[發明專利]一種檢測不同亞型禽流感病毒的方法及其專用試劑盒

無效

• 申請號: 200910243330.2
• 申請日: 2009-12-21
• 公開（公告）號: CN101724713A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 黃新;朱水芳;韓雪清;王慧煜;侯立華
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

1.一種檢測待測生物樣本中是否含有DNA片段甲和/或DNA片段乙的雙色熒光多重PCR方法，包括如下步驟：將待測生物樣本的總DNA作為模板，用引物對甲和引物對乙進行多重PCR；將多重PCR的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段乙，如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本中含有DNA片段甲；引物對甲的5’端用Tamra標記，引物對乙的5’端用Cy5標記；所述引物對甲用于擴增DNA片段甲；所述引物對乙用于擴增DNA片段乙。

2.一種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟：將待測生物樣本的cDNA為模板，用引物對A和引物對B進行多重PCR，將多重PCR的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進行凝膠掃描分析；如果635nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果532nm下具有熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；所述引物對A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra標記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5標記。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的反應條件為：95℃、5min；94℃、30s，52℃、60s，72℃、90s，35個循環；72℃、10min。

4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述多重PCR的反應體系中，反應初始時，每個引物對的上游引物和下游引物的濃度均為0.1mmol/L。

5.一種檢測待測生物樣本中是否含有H3亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的試劑盒，包括引物對A和引物對B；所述引物對A是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra標記；所述引物對B是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5標記。

6.一種檢測待測生物樣本中含有如下哪一種亞型禽流感病毒的方法：H1亞型禽流感病毒、H3亞型禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、N1亞型禽流感病毒、N2亞型禽流感病毒、H6亞型禽流感病毒和H9亞型禽流感病毒，包括如下步驟：

將待測生物樣本的cDNA作為模板，用引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、引物對V、引物對VI和引物對VII進行多重PCR，將多重PCR的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用熒光成像分析儀分別在532nm和635nm下進行凝膠掃描分析；如果635nm下具有641bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H1亞型禽流感病毒；如果635nm下具有708bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H3亞型禽流感病毒；如果635nm下具有419bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H5亞型禽流感病毒；如果532nm下具有367bp的熒光條帶，待測生物樣本含有N1亞型禽流感病毒；如果532nm下具有338bp的熒光條帶，待測生物樣本含有N2亞型禽流感病毒；如果532nm下具有724bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H6亞型禽流感病毒；如果532nm下具有532bp的熒光條帶，待測生物樣本含有H9亞型禽流感病毒；所述引物對I是序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對，序列2所示核苷酸的5’端用Cy5標記；所述引物對II是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸組成的引物對，序列4所示核苷酸的5’端用Cy5標記；所述引物對III是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸組成的引物對，序列6所示核苷酸的5’端用Cy5標記；所述引物對IV是序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸組成的引物對，序列8所示核苷酸的5’端用Tamra標記；所述引物對V是序列表的序列9所示核苷酸和序列表的序列10所示核苷酸組成的引物對，序列10所示核苷酸的5’端用Tamra標記；所述引物對VI是序列表的序列11所示核苷酸和序列表的序列12所示核苷酸組成的引物對，序列12所示核苷酸的5’端用Tamra標記；所述引物對VII是序列表的序列13所示核苷酸和序列表的序列14所示核苷酸組成的引物對，序列14所示核苷酸的5’端用Tamra標記。