[發明專利]一種組織工程微囊化肝細胞及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200910241907.6
• 申請日: 2009-12-15
• 公開（公告）號: CN101717767A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 王常勇;邱麗媛;段翠密;王滟濛;林秋霞
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C12N11/04;A61K35/407;A61K35/12;A61P1/16
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 史雙元

技術領域

本發明涉及動物細胞組織工程產品，更具體的說，涉及一種組織工程微囊化肝細胞及其制備方法和應用。

背景技術

肝功能衰竭是臨床難治性疾病，死亡率很高。目前，在臨床上治療肝衰竭可行的方法主要有以下兩種：肝臟移植與肝細胞移植。這些治療方式雖然能明顯改善患者癥狀，但也存在很多問題：如肝器官移植受到供體器官匱乏，高額費用和長期需要使用免疫抑制劑的限制。另外一種行之有效的方法是肝細胞的移植，如果在肝衰竭患者體內成功植入一定數量的肝細胞，其肝臟的功能將會得到提高，并明顯促進肝臟的再生。但是，在移植后機體會產生強烈的免疫排斥反應，從而導致移植最終失敗。盡管使用免疫抑制劑是一種常見的解決方法，但是它的毒副作用會使重癥肝病患者產生相關的并發癥。因此，微囊化細胞療法為無免疫抑制劑的情況下的細胞移植開辟了廣闊的前景。

微囊技術是指用半透膜包被生物活性物質以形成微囊的技術，形成的微囊可以阻遏免疫細胞以及大分子抗體通過半透膜，同時允許氧氣、營養物質和一些具有生物活性的小分子物質自由出入，因此，該技術是目前細胞治療、組織和器官替代治療的主要方法之一。自從1964年，Chang引用微囊技術進行細胞移植，并首次提出“人工細胞”的概念以來，微囊技術取得了迅速發展。隨后的二十年間，人們不斷嘗試用這種方法包埋胰島細胞來控制糖尿病小動物模型的高血糖。1986年，O’Shea等人在已有基礎上對成囊物質進行了革新，制成了海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊。近年來隨著生物材料、細胞生物學、工程科學的發展，為微囊化人工細胞研究提供了強大動力，并先后在基因工程細胞、嗜鉻細胞、干細胞以及胰島微囊化研究中取得可喜進展。

微囊具有良好的生物相容性，合適的半透性、較強的機械穩定性和較低的免疫原性。微囊膜可提供細胞附著的基質，使肝細胞相互接觸，并形成一種三維結構。此外，微囊膜的多孔性結構允許白蛋白、營養物質及代謝物的自由彌散，肝細胞可以跨膜獲得養分，但又能阻止高分子量物質如免疫球蛋白和補體通過，從而避免免疫細胞及免疫分子對囊內細胞的損傷，起到免疫屏障作用。2000年，有文獻報道肝細胞和干細胞進行微囊共包裹成功用于移植治療后，微囊化肝細胞在急性肝衰竭治療中的作用受到研究人員的廣泛青睞，研究進展迅速。

血管內皮細胞是形成血管網絡的主要功能細胞，在肝小葉中，內皮細胞和肝細胞互相連接排列形成多層三維組織結構，通過細胞連接、細胞外基質調控肝細胞的生長、分化、凋亡及功能。有研究證明，內皮細胞與肝細胞共培養能夠維持肝細胞的活性及功能。AKIRA?ITO等(Ito?A，Takizawa?Y，Honda?H，HataK，Kagami?H，Ueda?M，Kobayashi?T.Tissue?engineering?using?magnetitenanoparticles?and?magnetic?force：heterotypic?layers?of?cocultured?hepatocytes?andendothelial?cells，Tissue?Eng.，2004，10(5-6)：833-40)將磁力標記了的內皮細胞與肝細胞共培養，發現這種共培養的結構與同型單純肝細胞相比顯著提高了肝細胞的白蛋白分泌。Takayama等(Takayama?G，Taniguchi?A，Okano?T.Identificationof?differentially?expressed?genes?in?hepatocyte/endothelial?cell?co-culture?system，Tissue?Eng.，2007，13(1)：159-66)證實了將大鼠肝細胞與人臍帶靜脈內皮細胞雙層共培養后，與細胞連接相關的基因和肝特異性標志基因的表達都顯著提高，這表明即使不同種的細胞之間通過細胞外基質和細胞因子信號的連接，也會發生相互間的作用，因此共培養體系可以作為一種分析細胞間作用的有用的模型。但是上述模型都是體外模型，一旦移植到體內就會引起機體的免疫排斥反應，本發明中的微囊是一種生物相容性高，具有較低免疫原性的半透膜，在植入機體體內后可以保護微囊內部的細胞免受機體免疫系統的排斥，以達到更好的發揮細胞功能的目的。

目前國內外尚未見微囊化肝細胞和血管內皮細胞治療肝衰竭的相關報道。

發明內容

本發明的目的是要提供一種組織工程微囊化肝細胞及其制備方法。

一種組織工程微囊化肝細胞的制備方法，按照如下的操作步驟進行：