[發明專利]一種從棕色脂肪分離心臟干細胞及其成心肌分化的方法

有效

• 申請號: 200910241630.7
• 申請日: 2009-11-27
• 公開（公告）號: CN101705209A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 王常勇;劉志強;段翠密;周瑾;王海濱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 史雙元

1.一種從棕色脂肪分離心臟干細胞及其成心肌細胞分化的方法，其特征在于， 按照如下操作步驟進行：

(1)消化液的制備

將膠原酶、dispaseII與胰酶以質量比1∶1∶0.5-1的比例溶于無血清的培 養基中，其中，膠原酶、dispaseII和胰酶在無血清的培養基中的濃度均為 0.5-2mg/mL，完全溶解后，調節pH至7.2-7.4，獲得消化液；

(2)來源于棕色脂肪的原代心臟干細胞的分離

將清洗并剪碎的棕色脂肪組織加入到含有上述消化液的消化瓶中，每10 毫升消化液加入0.5-1.0克棕色脂肪組織，加蓋后放在磁力攪拌器上進行攪動， 轉速為80-120rpm，在37℃，5％CO₂的孵箱中消化45-60min，然后以血清終 止消化反應，其中，血清與消化液的體積比為1-2∶10，將消化液過濾后離心 收集細胞，即獲得原代心臟干細胞；其中，所述消化瓶中裝有玻璃珠和磁力攪 拌轉子；

(3)原代心臟干細胞的培養與成心肌細胞分化

使用含血清的α-MEM培養基重懸上述原代心臟干細胞，其中，血清的體 積百分比濃度為10％，然后以5×10³-5×10⁴/cm²的密度將原代心臟干細胞接種于 組織培養基中進行培養分化，隔天換組織培養基，培養2-4周，心臟干細胞可 分化為節律搏動的心肌細胞。

2.根據權利要求1所述的從棕色脂肪分離心臟干細胞及其成心肌細胞分化的方 法，其特征在于，步驟(1)中所述無血清的培養基為α-MEM或DMEM培養 基。

3.根據權利要求1所述的從棕色脂肪分離心臟干細胞及其成心肌細胞分化的方 法，其特征在于，步驟(3)中所述組織培養基為含體積百分比濃度為10％血清 的α-MEM培養基。