[發明專利]一種微生物體內合成生物柴油的方法

有效

• 申請號: 200910241540.8
• 申請日: 2009-11-25
• 公開（公告）號: CN102071228A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 呂雪峰;談曉明;段仰凱;蔡軻;朱至
• 申請（專利權）人: 青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 周長興

技術領域

本發明屬于可再生能源領域與生物質能源領域，具體地涉及一種在微生物體內從頭合成生物柴油的方法。?

背景技術

生物柴油，主要是以動植物油脂為原料油，通過化學法或酶法催化的酯交換工藝來制備。這種生產方式面臨的主要瓶頸問題是生產原料不足、甲醇的使用以及甘油副產物的去除等問題，而其中最主要的問題還是生產原料供應不足。目前，在工業上用于制備生物柴油的主要油脂資源(如大豆油、菜籽油等)同時也是人類生活所必須的，而大量種植油料植物來提供原料又存在著耕地不足以及季節氣候限制等問題。微藻油脂被認為是生產生物柴油比較合適的生物質資源，但是目前仍然面臨諸多技術瓶頸問題，未能實現大規模的利用。?

農作物秸稈和木屑等纖維素生物質資源極為豐富，而且長期以來沒有得到有效的利用。近年來，國內外興起了利用纖維素生物質制備生物乙醇的熱潮，其主要的流程就是將纖維素生物質水解成單糖類物質，然后再利用微生物發酵生產乙醇。所以，利用纖維素生物質制備生物乙醇，能夠在一定程度上解決生物乙醇生產領域原料供應的問題。如果能夠實現微生物發酵將糖轉化為生物柴油，那么豐富的纖維素生物質資源就能先水解成糖，進而轉化為生物柴油，這就能夠解決生物柴油生產中原料供應不足的問題。?

德國明斯特大學的Alexander?Steinbuchel教授領導的課題組通過基因工程改造，在大腸桿菌(Escherichia?coli，E.coli)中構建了一條長鏈脂肪酸乙醇酯的合成途徑，第一次實現了由糖到生物柴油的生物轉化，這項工作發表在“Microbiology”(Kalscheuer，R.，T.Stolting，et?al.(2006).“Microdiesel：Escherichia?coli?engineered?for?fuel?production.”Microbiology?152(Pt?9)：2529-2536.)。但是在Alexander?Steinbuchel團隊的這項成果中，雖然首次實現了生物柴油的微生物合成，但是仍然需要給大腸桿菌提供來自外源的長鏈脂肪酸；其得到的每分子脂肪酸乙醇酯中絕大部分的碳原子是外源脂肪酸提供的，所以還未能實現真正的微生物體內從頭合成生物柴油。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種微生物體內合成生物柴油的方法，在微生物體內構建一條由糖轉化到生物柴油的代謝途徑，實現生物柴油在微生物體內的從頭合成。?

為實現上述目的，本發明提供的微生物體內合成生物柴油的方法，主要步驟為：?

A)分別將不動桿菌蠟脂合成酶基因atfA、大腸桿菌脂酰輔酶A合成酶基因fadD、運動發酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因pdc和乙醇脫氫酶基因adhB四個基因克隆到表達載體pET28b上，基因的兩端分別帶上NdeI(5’端)和SpeI(3’端)酶切位點，使上述四個基因都置于T₇啟動子下游，由T₇啟動子驅動表達。?

B)通過SpeI和XbaI是同尾酶這一特點，將fadD基因插入到atfA基因片段后的SpeI位點得到質粒pXT9，將adhB基因插入到pdc基因片段后的SpeI位點得到質粒pXT10；再將pdc+adhB基因片度插入到atfA+fadD基因片段后的SpeI位點得到四個基因共表達的質粒pXT11；在質粒pXT11上，atfA+fadD+pdc+adhB四個基因置于同一個T₇啟動子的下游。?

C)將pXT11轉入到含有質粒pMSD8和pMSD15的大腸桿菌菌株得到大腸桿菌菌株XT31；pMSD8和pMSD15兩個質粒是分別用于在大腸桿菌中過量表達乙酰輔酶A脫羧酶和硫酯酶的。?

D)大腸桿菌菌株XT31經過IPTG和阿拉伯糖誘導產生生物柴油，即脂肪酸乙醇酯。?

本發明的優點是在同一株大腸桿菌中既引入運動發酵單胞菌(Zymomonas?mobilis?ZM4)的乙醇合成途徑，又大幅提高其脂肪酸的合成能力，還外源表達了不動桿菌(Acinetobacter?baylyi?ADP1)的蠟脂合成酶，?這樣就直接在大腸桿菌體內合成了生物柴油。利用這一技術來制備生物柴油既不需要通過酯化反應，也不需要外源添加長鏈脂肪酸，能夠大幅地削減生物柴油制備的成本。?

附圖說明

圖1為質粒pXT1的基本結構，pdc基因克隆于pGEMT-easy(Promega)載體，基因片段兩端帶有NdeI和SpeI位點。?