[發明專利]一種手足口病單、雙價基因工程亞單位疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 200910236590.7
• 申請日: 2009-11-03
• 公開（公告）號: CN101695569A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 趙忠鵬;李敏;高嘯;羅德炎;李曉楠;劉鑫;邢麗;段越強;楊鵬輝;王希良
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: A61K39/125
• 分類號: A61K39/125;A61K39/295;A61P31/14;C12N15/866;C12N7/04;C12R1/93
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種預防手足口病的單、雙價亞單位疫苗，其特征在于：

該單價亞單位疫苗由EV71?VLP抗原或Cox.A16?VLP抗原與Al(OH)₃佐劑按下述重量百分比含量配制而成：

EV71?VLP抗原或Cox.A16?VLP抗原????0.0015-0.003重量份

Al(OH)₃佐劑??????????????????????0.25-0.5重量份；

該雙價亞單位疫苗由EV71?VLP抗原和Cox.A16?VLP抗原與Al(OH)₃佐劑按下述重量百分比含量配制而成：

EV71?VLP抗原和Cox.A16?VLP抗原????0.0015-0.002重量份

Al(OH)₃佐劑??????????????????????0.25-0.5重量份；

其中EV71?VLP抗原和Cox.A16?VLP抗原的比例為1∶1。

2.如權利要求1所述的單、雙價亞單位疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

a，通過基因工程手段分別獲得重組桿狀病毒Bac-EV71-P1-3CD和Bac-Cox.A16-P1-3CD，分別在昆蟲細胞中高效共表達類似SeQ?ID?NO.1?EV71?P1、SeQ?IDNO.2?Cox.A16?P1和3CD蛋白，并分別自組裝成EV71?VLP和Cox.A16?VLP；

b，建立并檢定疫苗株三級種子批庫；

c，采用無血清培養基高密度懸浮培養來自Sf-9/Hi-5細胞系的昆蟲細胞；

d，在細胞長成1.5-2×10⁶細胞/ml時，接種重組桿狀病毒；

e，病毒在細胞中增殖并高效共表達P1和3CD蛋白，產生VLP；

f，裂解昆蟲細胞并收集細胞所產生的懸液，澄清過濾，去除昆蟲細胞殘渣；

g，超濾濃縮病毒VLP懸液；

h，超濾濃縮后的病毒懸液，通過凝膠過濾層析和離子交換層析純化病毒VLP，或者通過蔗糖密度梯度離心純化病毒VLP，得純化的病毒原液，即抗原；

i，配制及檢定單、雙價疫苗半成品及成品，測量疫苗的安全性、有效性及穩定性。

3.如權利要求2所述的單、雙價亞單位疫苗的制備方法，其特征在于：

其中a步驟中P1和3CD基因序列采用RT-PCR方法擴增手足口病病毒株獲得：SeQ?IDNO.1?EV71?P1和3CD基因序列利用RT-PCR方法擴增EV71(H13-Henan-08)病毒RNA獲得，SeQ?ID?NO.2?Cox.A16?P1和3CD基因序列利用RT-PCR方法擴增Cox.A16(S10-shandong-08)病毒RNA獲得，基因均克隆入pMD18-T載體后測序表明正確；P1和3CD基因序列也可采用全基因合成的方式獲得，并根據昆蟲偏愛密碼子進行優化。

4.如權利要求2或3所述的單、雙價亞單位疫苗的制備方法，其特征在于：

其中b步驟中建立并檢定疫苗株三級種子批庫，即原始種子批、主種子批和工作種子批的方法為：原始種子批為經過噬斑純化的Sf-9細胞上的4代毒種；驗明原始種子批的記錄、歷史、來源和生物學特性；從原始種子批在Sf-9細胞上傳至第5代為主種子批；主種子批在Sf-9細胞上繼續傳代總次數不超過12代制備工作種子批。

5.如權利要求2-4任一所述的單、雙價亞單位疫苗的制備方法，其特征在于：

其中f步驟中收獲細胞裂解所產生的懸液后通過濾器進行澄清過濾，濾器孔徑為0.45μm。

6.如權利要求2-5任一所述的單、雙價亞單位疫苗的制備方法，其特征在于：

其中g步驟中超濾濃縮病毒VLP懸液的超濾膜的截留分子量為100-300KD，濃縮倍數為100倍。