[發(fā)明專利]基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910236496.1
• 申請(qǐng)日: 2009-10-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101696451A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳澤良;王玉飛;鐘志軍;徐杰;杜昕穎;汪舟佳;孫巖松;黃留玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用，特別是涉及一種基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法及其在制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

1996年，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)由美國(guó)Applied?Biosystems公司首先推出。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time?quantitative?PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過(guò)與加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。

目前，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，熒光定量PCR技術(shù)主要分兩類，熒光染料和熒光探針。其中熒光探針包括Taqman探針、分子信標(biāo)、FRET探針、蝎式探針等。熒光染料主要包括YO-PRO-1、SYBR?Green?I、BEBO和LC?Green等。熒光染料定量PCR的優(yōu)勢(shì)在于它使用方便，不需要設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。而且，它能監(jiān)測(cè)任何雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，沒(méi)有引物特異性，可以用于不同的模板。然而，正是由于熒光染料能和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此它也能與非特異的雙鏈DNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。引物二聚體的問(wèn)題目前可以用熔解曲線(melting?curve)加以解決，來(lái)區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增。因此，作為一種方便快捷的定量PCR方法，熒光染料定量PCR應(yīng)用非常廣泛。

SYBR?Green?I因?yàn)槠涠拘缘汀r(jià)格便宜，成為最常使用的一種定量PCR熒光染料。但是，SYBR?Green?I也存在一些明顯的不足。例如，在未進(jìn)行優(yōu)化之前不能用于普通PCR緩沖液中，并且需要額外的試劑(如DMSO、BSA等)來(lái)增加反應(yīng)的效率。盡管通過(guò)提高M(jìn)gCl₂的濃度可以在一定程度上減小其抑制效應(yīng)，但SYBR?Green?I仍可以濃度依賴的方式抑制PCR反應(yīng)。這種抑制效應(yīng)可能是由于染料的分解產(chǎn)物所致。目前，SYBRGreen?I已被廣泛應(yīng)用于病原的檢測(cè)。但是，利用該染料所做的熔解曲線(Tm)可受到染料和DNA濃度的影響。例如，3倍濃度的起始DNA的差異，就可能引起1度的Tm值的變化。SYBR?Green?I的另一個(gè)缺點(diǎn)是在多重PCR中應(yīng)用有限。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增時(shí)，熔解曲線只能檢測(cè)到一個(gè)產(chǎn)物，而電泳分析可以明顯觀察到兩個(gè)產(chǎn)物。這個(gè)可能與擴(kuò)增DNA和染料的相對(duì)濃度有關(guān)。盡管SYBR?Green?I的應(yīng)用范圍較廣，但是存在染料可用濃度范圍小、序列結(jié)合偏性大等缺點(diǎn)。

SYTO家族的染料是一種比較常見(jiàn)的DNA結(jié)合染料，它具有很多特性，包括膜通透性、低細(xì)胞毒性、結(jié)合DNA后熒光增強(qiáng)等，這些特性使得它們適合于標(biāo)記活細(xì)胞。但是它們對(duì)雙鏈與單鏈DNA的特異性結(jié)合能力不清，或者說(shuō)它們作為定量PCR的染料是否合適仍不清楚。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種對(duì)PCR反應(yīng)的抑制效應(yīng)小、可用濃度范圍大、序列結(jié)合偏性小、敏感性高的新型DNA結(jié)合染料，并建立了基于該染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種基于新型DNA結(jié)合染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，是以SYTO為熒光染料進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

所述SYTO熒光染料優(yōu)選為SYTO82。

所述SYTO熒光染料的濃度優(yōu)選為2μM。

所述PCR反應(yīng)體系優(yōu)選為：10×PCR緩沖液2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，MgCl₂(25mM)2μl，上游引物(10μM)：0.5μl，下游引物(10μM)：0.5μl，rTaq酶(5U/μl)：0.125μl，模板DNA：1μl(含1.0×10¹～10⁹拷貝)，染料1μl，加水補(bǔ)齊至終體積25μl。

所述實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)選為：預(yù)變性：94℃?3min；擴(kuò)增95℃?30s，52℃?30s，72℃?30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃?10min。

所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可包括以下步驟：

1)將SYTO為熒光染料加入上述PCR反應(yīng)體系中；

2)按上述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。