[發明專利]一種用于PCR擴增的真菌DNA快速提取方法

有效

• 申請號: 200910235594.3
• 申請日: 2009-09-29
• 公開（公告）號: CN101696411A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 林彩麗;王曦茁;樸春根;田國忠;李永;汪來法;郭民偉
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/645;C12R1/79;C12R1/77
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種微生物的DNA提取方法，尤其涉及一種用于PCR擴增的真 菌DNA快速提取方法，屬于真菌分子生物學領域。

背景技術

隨著對真菌分子生物學的深入研究，在對真菌進行分子鑒定和分類及其基因 的克隆時需要少量的真菌基因組DNA做模板進行PCR擴增。真菌細胞壁厚，多 糖含量高，常用的真菌DNA提取方法是CTAB法。CTAB法提取的DNA純度較 高，但需要大量菌絲體且步驟繁瑣，首先將真菌菌絲體研磨破壁，高溫溫育，費 時費力。另外也有一些真菌DNA提取方法的報道但都離不開研磨破壁和酚氯仿抽 提蛋白等步驟。上述方法均難以應用于批量的真菌DNA提取。因此急需一種更為 簡便快速的方法少量提取真菌DNA用于后續的PCR擴增，以滿足對真菌分子鑒 定的需要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種快速、簡便、 經濟、低毒、易行的真菌DNA提取方法，

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種用于PCR擴增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步驟：

(1)培養有待提取DNA的真菌，得到真菌菌絲體；

(2)將所培養的真菌菌絲體置于裝有裂解液的離心管中；

(3)將離心管交替凍融；

(4)離心，取上清轉入無菌離心管，加入兩倍體積的95％乙醇，顛倒混勻， 液氮速凍后，離心，棄上清，將沉淀風干，用雙蒸水或1×TE溶液溶解，即得。

為了達到更佳的提取效果，優選的，步驟(1)中將待提取DNA的真菌在 PDA培養基上進行平板或斜面培養；

優選的，步驟(2)中將真菌菌絲體置于裝有100-500μl裂解液的微量離心管 中；更優選的，將真菌菌絲體置于裝有200μl裂解液的微量離心管中；其中，所述 裂解液的成份為：10mM?Tris-HCl，pH8.0，1mM?EDTA，250mM?NaCl，1％ SDS；

步驟(3)中所述的交替凍融優選為將離心管放置于液氮中速凍后迅速轉入沸 水中煎煮；更優選的，將裝有真菌菌絲體的離心管中置入液氮速凍中速凍30秒-2 分鐘然后迅速轉入沸水中煮2-10分鐘；最優選的，將裝有真菌菌絲體的離心管中 置入液氮速凍中速凍1分鐘然后迅速轉入沸水中煮5分鐘；步驟(3)中的交替凍 融次數可以為1-3次，為了達到更好的裂解效果，交替凍融的次數最好為2次；

步驟(4)中所述的離心在0-4℃的低溫條件下進行離心，離心轉速優選為 8000-16000rpm，更優選為12000rpm；其中，第一次離心的時間優選為1-3分鐘， 更優選為2分鐘；，第二次離心的時間優選為5-15分鐘，更優選為10分鐘。

其中，為了提高所提取的DNA的純度，步驟(4)中將沉淀風干之前，可加 入1ml的75％乙醇洗滌沉淀，4℃，12000rpm離心1min；

本發明的方法完全可用于所有的真菌DNA的提取，所述的真菌包括：側耳屬 真菌(Pleurotus)，細極鏈格孢菌(Alternaria?tenuissima)、葡萄座腔菌 (Botryosphaeria?dothidea(Moug.)Ces.&De?Not.)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、圍小叢殼菌(Glomerella?cingulata)、果生鏈核盤菌(Monilinia fructigena?Honey)、盤長孢狀刺盤孢菌(Colletotrichum?gloeosporioides)、淡紫擬青 霉(Paecilomyces?lilacinus(Thom.)Samson)等。

本發明方法較之傳統的CTAB法操作簡單，省去了采用液氮研磨步驟，省時 省力且減少了研磨過程中真菌DNA的損失；本發明方法采用液氮和沸水反復凍 融，使裂解液中蛋白和多糖含量比較少，無需再用苯酚和氯仿抽提，避免了有毒 試劑的接觸，加入乙醇后又用液氮處理提高了DNA沉淀效率。本發明方法所提取 的DNA完整性好，純度高，收率高，可直接用于PCR擴增反應，能夠高效擴增 出用于克隆和測序的目的產物。本發明方法大大提高真菌DNA的提取效率，降低 了真菌DNA提取的成本，從而可有效提高真菌的分子鑒定和檢測效率，降低鑒定 和檢測成本。

附圖說明