[發(fā)明專利]一種用于PCR擴增的真菌DNA快速提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910235594.3
• 申請日: 2009-09-29
• 公開（公告）號: CN101696411A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發(fā)明（設計）人: 林彩麗;王曦茁;樸春根;田國忠;李永;汪來法;郭民偉
• 申請（專利權）人: 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/645;C12R1/79;C12R1/77
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種用于PCR擴增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)有待提取DNA的真菌，得到真菌菌絲體；所述的真菌選自刺芹側(cè) 耳(Pleurotus?eryngii)、白黃側(cè)耳(Pleurotus?cornucopiae)、袖珍側(cè)耳 (Pleurotus?geesteyanus)、虎奶菇(Pleurotus?tuber-regium)、長柄平菇 (Pleurotus?spodoleucus)、平菇(Pleurotus?ostreatus)、鮑魚側(cè)耳(Pleurotus? abalonus)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria?dothidea)、尖孢鐮刀菌(Fusarium? oxysporum)、圍小叢殼菌(Glomerella?cingulata)、果生鏈核盤菌(Monilinia? fructigena)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum?gloeosporioides)或淡紫擬青霉 (Paecilomyces?lilacinus)；

(2)將真菌菌絲體置于裝有裂解液的離心管中；所述裂解液的組成成份為： 10mM?Tris-HCl，pH8.0，1mM?EDTA，250mM?NaCl，1％SDS；

(3)將離心管交替凍融；所述的交替凍融是指裝有真菌菌絲體的離心管中置 入液氮中速凍30秒-2分鐘然后迅速轉(zhuǎn)入沸水中煮2-10分鐘；

(4)離心，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管，加入兩倍體積的95％乙醇，顛倒混 勻，用液氮速凍，離心，棄上清，將沉淀風干，即得。

2.按照權利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟(1) 中將待提取DNA的真菌在PDA培養(yǎng)基上進行平板或斜面培養(yǎng)。

3.按照權利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟(2) 中將真菌菌絲體置于裝有100-500μl裂解液的微量離心管中。

4.按照權利要求3所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：將真菌菌 絲體置于裝有200μl裂解液的微量離心管中。

5.按照權利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟(3) 中所述的交替凍融是指將裝有真菌菌絲體的離心管中置入液氮中速凍1分鐘然后 迅速轉(zhuǎn)入沸水中煮5分鐘。

6.按照權利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟 (3)中所述的交替凍融的次數(shù)為1-3次。

7.按照權利要求6所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟(3) 中所述的交替凍融的次數(shù)為2次。

8.按照權利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟(4) 中，所述的離心在0-4℃的低溫條件下進行離心，離心轉(zhuǎn)速為8000-16000rpm。

9.按照權利要求8所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：所述的離 心在4℃的低溫條件下進行離心，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm。

10.按照權利要求8所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟 (4)中第一次離心的時間為1-3分鐘；第二次離心的時間為5-15分鐘。

11.按照權利要求10所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟 (4)中第一次離心的時間為2分鐘；第二次離心的時間為10分鐘。

12.按照權利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于：步驟 (4)中將沉淀風干之前，加入1ml的75％乙醇洗滌沉淀，4℃，12000rpm離心1 分鐘。