[發明專利]一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法

無效

• 申請號: 200910235401.4
• 申請日: 2009-10-13
• 公開（公告）號: CN102040655A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 李毅;高鋒;魏春紅
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07K14/14
• 分類號: C07K14/14;C12N15/46;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/00;C12N15/82;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法。

背景技術

水稻矮縮病毒(rice?dwarf?virus，RDV)是水稻普通矮縮病的病原，1883年首次在日本被發現，廣泛分布于中國、日本、朝鮮、菲律賓、尼泊爾等東南亞水稻產區。此病在水稻秧田和本田期均能發生，為系統性侵染病害。植株感病后，所有分蘗均能發病。癥狀為植株顯著矮縮，分蘗增多，葉色濃綠，葉片粗而僵直，沿葉脈出現白色小斑點，形成斷續的點線狀(老葉不出現斑點)；如在孕穗后期發病，只在劍葉及其葉鞘上表現清晰的條點病斑；若在抽穗后發病，僅在劍葉葉鞘上表現病斑。病株根系發育不良，多老朽根，早期發病(苗期到分蘗期)一般不能抽穗，后期發病呈包莖穗或半包穗，穗小秕谷多。因此，水稻感染該病后能夠造成大面積減產，嚴重威脅水稻的生產。

RDV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員(Boccardo?G，1984)。呼腸孤病毒科病毒有一些共同特點，例如病毒粒子呈球狀，有雙層衣殼，每個衣殼均呈現20面體對稱，直徑為60-80nm，沒有脂蛋白外膜，外殼由3種蛋白質組成，核心有4-6種蛋白，核心內含有線狀dsRNA，有10-12個基因組分。RDV病毒粒子為無刺突、無脂蛋白外膜的二十面體，病毒粒子直徑為69.3nm，具有雙層外殼蛋白，內殼直徑為53nm。RDV病毒粒子內有單拷貝基因組12條雙鏈RNA，RNA基因組分以超卷曲形式包裝在病毒粒子內，與蛋白質組成復合體。依照dsRNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率，由慢到快，依次命名為S1到S12。RDV基因組編碼6-7種結構蛋白(包括P1，P2，P3，P5，P7，P8和P9)，和至少五種非結構蛋白(包括Pns4，Pns6，Pns10，Pns11，Pns12)。

Pns11的編碼序列有兩個ORF，這兩個ORF的讀碼框相同，但第二個ORF的AUG密碼子滿足Kozak保守轉錄的要求，在感病的植株和昆蟲體內表達量較高。其編碼一個181個氨基酸組成的20KD蛋白。S11的3’非編碼區很長，占整個片段的46.4％，遠遠高于RDV其他片段3′非編碼區的相對長度(約占3.1％-17.7％)。

發明內容

本發明的目的是提供一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法。

本發明提供了一種具有細胞核和/或葉綠體定位功能的多肽，其氨基酸序列如序列表的序列1所示。

編碼所述多肽的DNA片段也屬于本發明的保護范圍。

所述DNA片段的核苷酸序列可如序列表的序列2所示。

含有所述DNA片段的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

所述重組表達載體可為將編碼所述多肽的DNA片段插入載體pRTL2的多克隆位點得到的重組質粒。

本發明還保護一種在植物細胞的細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法，是用所述多肽作為信號肽引導外源蛋白在植物細胞的細胞核和/或葉綠體中定位表達。

所述方法可通過將含有所述DNA片段和所述外源蛋白的編碼基因的融合DNA導入植物細胞實現；所述融合DNA中，編碼所述多肽的DNA片段位于所述外源蛋白的編碼基因的上游。具體來說，所述融合DNA通過如下重組表達載體導入所述植物細胞：骨架質粒為pRTL2，在35S啟動子后依次插入編碼所述多肽的DNA片段和外源蛋白的編碼基因。

所述植物細胞為可煙草細胞，如煙草BY2細胞。

所述外源蛋白可為GFP蛋白。所述GFP基因具體可為GENBANK?ACCESSIONNUMBER：U55761中自5’末端第97至816位核苷酸序列所示的DNA。所述融合DNA具體可為序列表的序列6所示的DNA。

本發明通過實驗證實了水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pns11的C端132-180多肽(第二個ORF)具有將外源蛋白特異定位到細胞核和葉綠體中的功能。不僅為在細胞核中特異表達抗逆，抗病害相關基因，提高植物生存能力提供了良好技術路線，同時也為在葉綠體中表達激活光合作用反應的相關基因，提高農作物生物產量提供了新的技術支持。本發明在實際生產中有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為pRTL2-S11::eGFP在煙草表皮細胞中的瞬時表達；A：pRTL2-S11::eGFP熒光；B：pRTL2-S11::eGFP可見光；C：pRTL2-S11::eGFP熒光和可見光疊加；D：pRTL2-eGFP熒光；E，F：pRTL2-S11::eGFP在煙草表皮細胞核中定位的放大圖。