[發明專利]菌核凈的多克隆抗體及其制備和應用

無效

• 申請號: 200910232823.6
• 申請日: 2009-10-20
• 公開（公告）號: CN101691404A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 劉媛;劉賢金;張存政;劉蓉蓉
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/765;C07K14/77;C07K1/113;G01N33/566;G01N33/531
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域：

本發明涉及一種菌核凈的多克隆抗體及其制備和應用。

背景技術：

菌核凈(Dimethachlon)是一種二甲酰亞胺類殺菌劑，又名紋枯利，商品名為奧力(Ohric)，它的有效成分是(N-3，5-二氯苯基)丁二酰亞胺(NDPS)。具有直接殺菌、內滲治療、抗雄激素作用，殘效期長，對于油菜菌核病、煙葉赤腥病、水稻紋枯病、麥類赤霉病、白粉病以及工業防腐具有良好的防效作用。但是，到了80年代初，人們開始逐漸認識到NDPS對人體健康可能具有潛在的危害(主要是腎臟毒性)，這樣致使菌核凈在農業上的廣泛使用受到限制。

目前對菌核凈殘留檢測的研究只有氣相色譜法(參見Liμ?HC，Li?QW，Tang?LB.Capillary?gas?chromatographic?determination?of?dimethachlon?residμes?in?fresh?tobacco?leaves?andcμt-tobacco[J].J?Zhejiang?Mniv?Sci?B.2007?Apr；8(4)：272-6；施介華.氣相色譜法測定菌核凈原粉[J].農藥，1996，35(6)：23-24)，劉蓉蓉等在2007年報道了菌核凈半抗原設計、合成與鑒定(參見劉蓉蓉，劉賢進，劉媛，方敦煌，胡秋輝.菌核凈殘留免疫分析半抗原的制備和鑒定[J].食品科學，2007，28(2)：223-226)，但是菌核凈的抗體制備以及免疫分析法和及其在煙葉中殘留的檢測中的應用，國內外均沒有文獻報道。

發明內容：

本發明的目的在于：針對目前菌核凈農藥殘留檢測方法單一的問題，檢測效率低的實際問題，提供一種菌核凈的多克隆抗體及其制備方法，并通過該多克隆抗體快速檢測農藥殘留。

本發明的目的是這樣實現的：一種菌核凈的多克隆抗體，由半抗原與牛血清蛋白BSA偶聯獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得，其特征在于：半抗原為菌核凈-2-戊二酸半酯。

上述菌核凈的多克隆抗體的制備，其特征在于：將菌核凈-2-戊二酸半酯用活性酯法與牛血清白蛋白偶聯，合成免疫抗原，再將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得菌核凈的多克隆抗體。

在菌核凈的多克隆抗體的制備中：活性酯法合成免疫抗原的步驟是：

稱取21mg菌核凈-2-戊二酸半酯溶于0.4mL二甲基甲酰胺中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺7.17mg和環二己基碳酰亞胺13.76mg，充分混勻，室溫避光靜置過夜；

次日10000g離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg牛血清白蛋白BSA的硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液的pH為8.7，反應液在室溫下繼續磁力攪拌4小時；

反應結束后，將反應混合液裝入透析袋中，在去離子水中4℃透析3天，每8小時換水一次，透析結束后獲得免疫抗原，分裝并保存于-20℃冰箱中備用。

上述菌核凈的多克隆抗體的應用，其特征在于：將所述多克隆抗體采用間接競爭性ELISA法對標本中菌核凈農藥的殘留進行檢測，檢測中使用的包被抗原為半抗原通過活性酯法與卵清蛋白OVA的偶聯物。

在菌核凈的多克隆抗體的應用中：活性酯法合成包被抗原的步驟是：

稱取21mg菌核凈-2-戊二酸半酯溶于0.4mL二甲基甲酰胺中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺7.17mg和環二己基碳酰亞胺13.76mg，充分混勻，室溫避光靜置過夜；

次日10000g離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg卵清蛋白OVA的硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液的pH為8.7，反應液在室溫下繼續磁力攪拌4小時；

反應結束后，將反應混合液裝入透析袋中，在去離子水中4℃透析3天，每8小時換水一次，透析結束后獲得包被抗原，分裝并保存于-20℃冰箱中備用。

在菌核凈的多克隆抗體的應用中：多克隆抗體采用間接競爭性ELISA法對樣品中菌核凈農藥的殘留進行檢測是指：將被測植物樣品提取、凈化后制備得到ELISA待測液，然后利用間接競爭性ELISA法進行檢測，最后通過標準曲線計算出待測樣品中的菌核凈含量。

本發明的優點在于：菌核凈的多克隆抗體的制備方法簡單，可以用于對樣本中的菌核凈農藥殘留進行快速檢測，與現有的儀器分析方法相比，檢測方法具有簡單、快速、檢測成本低、適合大量樣品快速篩查檢測。

附圖說明

圖1是菌核凈半抗原(hapten)、BSA及偶聯物(hap-bsa)的紫外掃描圖譜；

圖2是菌核凈半抗原(hapten)、OVA及偶聯物(hap-ova)的紫外掃描圖譜；