[發(fā)明專利]一種環(huán)丙沙星的檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910232655.0
• 申請日: 2009-12-04
• 公開（公告）號: CN101713778A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸茂林;宓曉黎;李利東;黃麗俊;李英;張六六;儲敏
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省微生物研究所有限責任公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)的檢測試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(Time?resolvedfluoroisnmunoassay，TRFIA)技術(shù)領(lǐng)域，用于動物源性食品、血液、尿液及飼料中環(huán)丙沙星藥物殘留量的檢測。

背景技術(shù)

環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)，又稱環(huán)丙氟哌酸，屬于第三代喹諾酮類抗菌合成藥物，其抗菌譜廣、抗菌活性強，是現(xiàn)在臨床應(yīng)用的氟喹諾酮類藥物中抗菌活性最強的藥物之一，已廣泛應(yīng)用于人類臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)。由于這類藥易誘發(fā)細菌耐藥性，長期應(yīng)用會出現(xiàn)蓄積中毒，從而可引起關(guān)節(jié)軟骨病、光敏反應(yīng)、肝腎毒性及導(dǎo)致淋巴細胞染色體變異的基因毒性，以及可引起人肌腱破裂。它作為一種人畜共用藥，藥物殘留通過食物鏈對人體健康危害更大，不利于該類藥物對人類疾病的治療。因此加強對該藥在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)督就顯得非常必要。歐盟、美國、日本、中國等均對動物源性食品中環(huán)丙沙星最高殘留限量都作了禁用或限用的規(guī)定。

目前檢測動物源性食品中環(huán)丙沙星殘留的主要方法有微生物法、熒光法、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)、毛細管電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。常用的環(huán)丙沙星檢測方法是色譜檢測法和免疫學檢測法。色譜檢測法靈敏、準確，需要昂貴的儀器和專門的工作人員，而且樣品處理較煩瑣，其應(yīng)用受到一定的限制，尤其是在基層大規(guī)模篩選和現(xiàn)場檢測中更加突出。免疫學檢測法靈敏、特異、快速、簡便，克服了以上的不足，適合大規(guī)模篩選。

時間分辨熒光免疫分析檢測技術(shù)是近來發(fā)展迅速的高靈敏檢測手段。TRFIA其原理是利用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，其一端和鑭系元素結(jié)合，另一端和抗體(抗原)上的自由氨基連接，制成Eu³⁺標記抗體(抗原)，它與待測樣品中的抗原(抗體)結(jié)合成免疫復(fù)合物。理想情況下，測定復(fù)合物中鑭系元素的熒光強度就能確定樣品中抗原的含量，但實際上這種復(fù)合物的熒光強度相當弱，只有再加入一種增強溶液(Enhancement?solution)，使鑭系元素從復(fù)合物中解離下來，并與增強液中所含的β-奈甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微膠囊，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，即可確定樣品中抗原的量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)丙沙星檢測試劑盒及檢測方法，用于定性或定量地檢測動物源性食品、血液、尿液及飼料中環(huán)丙沙星的殘留量；檢測時間短、平均回收率高、批內(nèi)、批間誤差小，并具有簡便、快速、準確的特點。

本發(fā)明的技術(shù)方案：該環(huán)丙沙星檢測試劑盒是由1、多孔包被板，2、緩沖液，3、環(huán)丙沙星標準溶液，4、環(huán)丙沙星抗體，5、銪標記羊抗兔抗體，6、洗滌液，7、增強液所組成。

本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)來檢測CIP。采用TRFIA的技術(shù)主要有兩個方面：第一，特異性多克隆抗體的制備，利用人工抗原免疫家兔，獲得含有抗體的血清，經(jīng)過生化提純分離免疫球蛋白；第二，Eu³⁺標記羊抗兔抗體的制備。

測定方法為：測定的基礎(chǔ)是標記免疫反應(yīng)。包被有CIP-載體蛋白的微孔板，加入CIP標準溶液或樣品處理液到各自的微孔中、再加入CIP抗體，振蕩反應(yīng)，游離的CIP與微孔板上的CIP-載體蛋白競爭CIP抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的CIP抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu³⁺-羊抗兔抗體，進行標記免疫反應(yīng)，再用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒有連接的Eu³⁺-羊抗兔抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中CIP的量。

本發(fā)明的有益效果：該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，可以達到0.01ng/mL以上。

附圖說明

圖1：環(huán)丙沙星檢測試劑盒示意圖。1、多孔包被板，2、緩沖液，3、環(huán)丙沙星標準溶液，4、環(huán)丙沙星抗體，5、銪標記羊抗兔抗體，6、洗滌液，7、增強液。

圖2：CIP-TRFIA標準曲線圖。

具體實施方式

實施例1：試劑盒的制備和動物源性食品檢測

免疫抗原的制備：

本發(fā)明所述的免疫抗原為將環(huán)丙沙星采用混合酸酐法與大分子載體蛋白結(jié)合，以合成的CIP-BSA作為免疫抗原進行動物免疫。