[發明專利]一種環丙沙星的檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910232655.0
• 申請日: 2009-12-04
• 公開（公告）號: CN101713778A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 陸茂林;宓曉黎;李利東;黃麗俊;李英;張六六;儲敏
• 申請（專利權）人: 江蘇省微生物研究所有限責任公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測環丙沙星的時間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是由多孔包被板(1)，緩沖液(2)，環丙沙星標準溶液(3)，環丙沙星的抗體(4)，銪標記的羊抗兔抗體(5)，洗滌液(6)和增強液(7)所組成。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/L?pH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的緩沖液將CIP-OVA稀釋至10mg/L做為包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置過夜，棄去包被液，沖洗三次，加150μL含3g/L?OVA的上述緩沖液封閉，4℃放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-18℃冷凍保存。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的環丙沙星標準溶液(3)，從CIP純品中稀釋得到，稀釋液為0.1mol/L?pH7.5磷酸鹽緩沖液，共6瓶，CIP濃度分別為：0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，100ng/mL。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的環丙沙星的抗體(4)，用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1.2mL混合2mg?CIP-BSA，用勻漿器混合2小時，制得油包水抗原乳化劑，取600μL制備好的油包水抗原乳化劑，在新西蘭大白兔和BALB/c小白鼠身上多位點地進行皮下注射，在免疫3～4次后，可進行鑒定，血清和腹水合格后稀釋、分裝、凍干備用。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗兔抗體(5)，將購得的羊抗兔抗體，經PD-10柱轉換緩沖條件至pH9.0，收集蛋白峰，取已轉換的羊抗兔抗體加入Eu³⁺-N₂-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸，反應過夜，反應液經柱層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中的銪標記的羊抗兔抗體(5)，取溶解于50mmol/L?PBS?pH7.0的5g/L羊抗兔抗體1mL～2mL，經PD-10柱轉換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/L?NaCl的50mmol/LNa₂CO₃-NaHCO₃pH8.5～9.0緩沖液，收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量，用上述洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L，取500μL～1000μL稀釋后的羊抗兔抗體加入含0.2mg～0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28℃～30℃磁力攪拌反應16小時，反應液經用80mmol/L?Tris-HCl?pH7.8緩沖液平衡的Sephadex-G50柱(1×40cm)層析，收集蛋白峰，稀釋、分裝備用。

7.一種用權利要求1所述的試劑盒檢測環丙沙星的方法，其特征是取包被有CIP-OVA的微孔包被板，加入CIP標準溶液或樣品處理液到各自的微孔中，再加入CIP抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加銪標記的羊抗兔抗體，進行標記免疫反應，洗滌液洗滌，加增強液振蕩后測量熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的CIP含量。

8.根據權利要求8所述的檢測環丙沙星的方法，其操作為：取包被有CIP-OVA的微孔包被板，加入50μL的CIP標準或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μL以緩沖液(2)作稀釋劑，1∶20稀釋CIP抗體，25℃～37℃振蕩0.5～1小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)1∶20稀釋的100μL?Eu³⁺-羊抗兔抗體，25℃～37℃振蕩0.5～1小時，用洗滌液洗六次，加200μL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，從標準曲線計算樣品中CIP的含量。