[發明專利]IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計

無效

• 申請號: 200910232402.3
• 申請日: 2009-11-27
• 公開（公告）號: CN101818162A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 王忠燦;王永山;劉小娟;歐陽偉;王曉麗;諸玉梅;唐雨德
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所;江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/70;C12P21/02;G01N33/569;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計，具體涉及傳染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原表位與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)嵌合基因的分子設計、技術路線、基因序列、表達質粒及其表達產物，屬于生物制藥領域。

二、背景技術

傳染性法氏囊病(Infectious?Bursal?Disease，IBD)是當今危害最嚴重的禽病之一，由傳染性法氏囊病病毒(Infectious?Bursal?Disease?Virus，IBDV)引起的以侵害雛雞中樞免疫器官-法氏囊為主要特征。該病不僅引起患病動物死亡，而且還導致機體免疫抑制，使機體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗。每年因IBD發病、免疫失敗、免疫抑制造成的經濟損失巨大[王永山等.近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征.中國獸醫科學，2008，38(12)：1013-1019]。接種疫苗是當前防控IBD最有效的方法，目前使用的中強毒力活疫苗存在著較大的生物安全問題，因為在不同IBDV毒株之間潛在著基因重配的可能，滅活疫苗也存在著抗原制備的困難。由于該病毒易變，在生產實踐中要求IBD疫苗不斷更新以應對新出現的IBDV變異株。

IBDV屬雙RNA病毒科，基因組包括大(A)小(B)兩個片段，有五種病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP1由B片段編碼，為病毒自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶。其它四種病毒蛋白由A片段編碼的多聚蛋白加工而成：VP2和VP3是病毒的主要結構蛋白，構成病毒衣殼，VP4為病毒自身蛋白酶，VP5為病毒的非結構蛋白，與病毒的毒力和復制效率有關。VP2是病毒的主要保護性抗原，病毒中和表位主要在VP2上，并且多為構象依賴性，其立體結構對病毒中和表位的形成至關重要。以VP2為靶基因的IBD基因工程疫苗已進行了多年研究。分析目前的研究進展，三個方面難以兼顧：一是提高重組IBDV蛋白的表達量，二是簡化原核表達的重組IBDV蛋白復性工藝，三是解決源于一種毒株的重組蛋白不適用于其它變異毒株的問題，由此導致的較高生產成本是影響獸用基因工程疫苗推廣應用的主要原因。因此，探索新的IBD基因工程疫苗技術路線是十分必要的。

抗原表位是蛋白質抗原性的物質基礎，重組蛋白的正確復性是構象依賴性表位形成的關鍵，構象依賴性中和抗原表位和免疫優勢表位的丟失將影響到機體產生完全有效的保護性免疫應答。此前，本專利申請人根據5個IBDV抗原表位基序構建線性串聯模擬IBDV多表位基因5epis，在多表位基因中，用線性化序列模擬了IBDV空間構象依賴性抗原表位，將人工合成的5epis在大腸桿菌中表達，重組多表位蛋白5EPIS可刺激機體產生抗IBDV感染的保護性免疫應答[Wang?YS(王永山)，et?al(等).Development?of?amulti-mimotope?peptide?as?a?vaccine?immunogen?for?infectious?bursal?disease?virus.Vaccine，2007，25(22)：4447-4455.]。但這種單純用抗原表位串聯的方法得到的多表位分子量小，其表達量、免疫原性以及免疫效力都有待進一步提高。因此，探索模擬IBDV抗原表位分子構建模式，進一步增強其分子的穩定性、免疫原性及其免疫效力是十分必要的，這不僅可以拓寬IBD新型檢測試劑和表位型基因工程疫苗的研究策略，而且具有良好的應用前景。

三、發明內容

技術問題

抗原表位是蛋白質抗原性的物質基礎，重組蛋白的正確復性是構象依賴性表位形成的關鍵，構象依賴性中和抗原表位和免疫優勢表位的丟失將影響到機體產生完全有效的保護性免疫應答。近年來，隨著對病毒抗原表位的分析，在一些分子量較大的病毒保護性免疫原中除了與免疫保護有關的中和表位外，還有非中和表位、抑制性表位甚或是毒性表位，這些表位會影響疫苗的免疫效果。單一抗原表位通常由數個氨基酸殘基組成，其分子量很小，在體內的穩定性和免疫原性都很弱，因此，在應用于表位型基因工程疫苗研究時，需要采取多表位的方法，以增強其免疫原性、穩定性和免疫效力。已有的實驗結果表明，采用多個表位串聯的方法可以增強免疫原性，多表位有利于提供更完全和更有針對性的免疫保護，但并不是拷貝數越多越好，只有串聯適量的拷貝數，才能夠刺激機體產生最大量的中和抗體。此外，抗原表位、連接方法以及表達系統等都會影響到多表位蛋白的免疫效力，表位的加工效率也是影響多表位蛋白免疫原性的重要因素。由于表位自身性質和組合方式的不同，對多表位疫苗的分子設計方案還沒有一成不變的優化規律。