[發明專利]IBDV抗原表位與HBcAg嵌合基因的分子設計

無效

• 申請號: 200910232402.3
• 申請日: 2009-11-27
• 公開（公告）號: CN101818162A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 王忠燦;王永山;劉小娟;歐陽偉;王曉麗;諸玉梅;唐雨德
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所;江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/70;C12P21/02;G01N33/569;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.模擬傳染性法氏囊病病毒IBDV多表位5epis與乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg嵌合基因，該嵌合基因mHBc-5epis序列為SEQ?ID?NO.1。

2.權利要求1所述嵌合基因的重組蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.2。

3.根據權利要求2所述的重組蛋白，是通過分子設計獲得的，具體包括：

第一步：根據HBcAg基因序列設計引物，并在正向引物P1與反向引物P2的5′端分別加上酶切位點Nco?I與Hind?III：

P1：5′-GATATACCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′

P2：5′-GTTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3′

以肝炎患者血清為模板用PCR擴增HBcAg基因片段500bp，與pMD18-T載體連接，轉化E.coli?TOP10感受態細菌，獲得含有HBcAg基因的重組克隆質粒pMD-HBc；

第二步：運用重疊延伸PCR技術在重組克隆質粒pMD-HBc中的HBcAg基因的231～232位核苷酸，即77～78位氨基酸殘基之間插入BamH?I和EcoR?I酶切位點，在重疊延伸PCR引物P3和引物P4的5′端分別加上酶切位點BamH?I和EcoR?I：

P3：5′-GAATTCTGGATCCTCCAAGTTATTACCCAC-3′

P4：5′-GGAGGATCCAGAATTCTCCCCAGCATCTAGG-3′

以pMD-HBc為模板，分別用引物P1和P3，引物P4和P2擴增得到PCR產物P13和P42，再以P13和P42共同作模板，用引物P1和P2擴增得到PCR產物，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的DNA片段，構建含BamH?I和EcoR?I位點的HBcAg修飾基因Modified?HBc，簡稱mHBc，與pMD18-T載體連接，可見兩條大小分別約為580bp和2700bp的條帶，獲得含BamH?I和EcoR?I位點的HBcAg修飾基因mHBc重組克隆質粒pMD-mHBc；將pMD-mHBc和pET-28a分別用NcoI和HindIII酶切，構建含有BamH?I和EcoR?I酶切位點的mHBc重組原核表達質粒pET-mHBc；

第三步：根據模擬IBDV多表位基因5epis以及HBcAg修飾基因表達質粒pET-mHBc的雙酶切位點和閱讀框，設計引物，并分別在正、反向引物的5′端加上酶切位點BamH?I和EcoR?I：

正向引物5′-GCGGATCCCATGCCTAAGACTCATAATTCTGGTC-3′

反向引物5′-GCGAATTCAAACCAATTAGTAAAACCATGCCCATG-3′

以pET-5epis為模板，用PCR方法在5epis基因的5′和3′端分別加入BamH?I和EcoRI酶切位點，構建5epis亞克隆質粒pMD-5epis；

將pET-mHBc與pMD-5epis分別用BamH?I和EcoR?I雙酶切，回收pET-mHBc片段和5epis片段，用T4?DNA連接酶連接，轉化E.coli?TOP10感受態細菌，獲得IBDV抗原表位嵌合基因mHBc-5epis表達質粒pET-mHBc-5epis。

第四步：將pET-mHBc-5epis轉化宿主菌E.coli?BL21(DE₃)，涂布1.5％瓊脂LB平板該平板含卡那霉素100μg/mL，挑取單菌落接種于含卡那霉素100μg/mL的LB液體培養基中，37℃，200r/min振搖16h，再按1％的體積吸取菌液接種于含卡那霉素100μg/mL的LB液體培養基中，37℃，200r/min振搖至菌液A₆₀₀＝0.6～0.8，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，200r/min，誘導培養4h，收集重組菌培養物，獲得IBDV抗原表位5epis與HBcAg嵌合基因病毒樣顆粒重組蛋白。

4.權利要求2或3所述嵌合基因重組蛋白在IBD新型檢測試劑或基因工程疫苗方面的應用。