[發明專利]半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒--9046

無效

• 申請號: 200910231963.1
• 申請日: 2009-12-04
• 公開（公告）號: CN102087274A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N21/31;G01N21/33;C12Q1/48;C12Q1/25;C12Q1/32
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1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的半乳糖濃度測定方法，其測定的技術原理是根據下述半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、丙酮酸脫氫酶的系列催化反應完成：

半乳糖+腺苷三磷酸??半乳糖激酶??腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸

腺苷二磷酸+磷酸根+去硫代生物素??去硫代生物素合成酶

腺苷三磷酸+7，8-二氨基壬酸+二氧化碳

二氧化碳+乙酰-輔酶A+還原型輔酶??丙酮酸脫氫酶丙酮酸+

輔酶A+輔酶

2.一種半乳糖的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下：

2.1樣品準備：

2.1.1標準樣品的制備

將一定量的半乳糖溶于水或緩沖液中，再將其濃度調整到100微摩爾/升；

2.1.2待測樣品預處理

待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；

2.1.3空白樣品

所述的水或緩沖液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升；

2.2試劑溶液的制備：

分別移取或稱取緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、去硫代生物素合成酶、丙酮酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽(磷酸根)、去硫代生物素與乙酰-輔酶A，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L與1-100mmol/L；

2.3待測樣品與在步驟2.2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45℃下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；

2.4在與步驟2.3)同樣的條件下測定步驟2.1.1)標準樣品的吸光度隨時間的變化；

2.5在與步驟2.3)同樣的條件下測定在步驟2.1.3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；

2.6數據處理

由步驟2.3-2.5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到半乳糖的含量：

式中：

ΔA(樣品)表示步驟2.3)得到的待測樣品的吸光度變化；

ΔA(空白)表示步驟2.5)得到的空白溶液的吸光度變化；

ΔA(標準)表示步驟2.4)標準樣品的吸光度變化。

3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定：測定方法為終點法，溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。

4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio-NADH的還原型輔酶。