[發明專利]利用特異性引物對大菱鲆FF0922微衛星標記的檢測方法

無效

• 申請號: 200910230906.1
• 申請日: 2009-11-20
• 公開（公告）號: CN101705296A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 馬愛軍;侯仕營
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 袁和善

技術領域：

本發明屬于大菱鲆DNA分子遺傳標記技術，是一種檢測大菱鲆FF0922微衛星標記技術方法。

背景技術：

本發明做出之前，國內外有類似的報道，國內中國水產科學院黃海水產研究所陳松林等(Molecular?Ecology?Notes?2007)發表的Isolation?andcharacterization?of?polymorphic?microsatellite?loci?from?ESTlibrary?of?turbot(Scophthalmus?maximus)and?cross-speciesamplification，曾報道了大菱鲆部分微衛星位點的檢測方法，但大菱鲆基因組文庫并非自己構建，而是從已有的報道里選取的；孫效文等(ConservGenet?2009)發表的Isolation?and?characterization?of?microsatellitemarkers?for?turbo(Scophthalmus?maximus)by?screening?SSR-enrichedlibrary，曾報道了大菱鲆部分基因組文庫的構建、含微衛星序列的篩選等內容，但其有的引物擴增出的序列等位基因太少，多態性不高，從而導致應用時不能有效地區分不同群體或個體；西班牙Pardo等(Genome?2007)發表的Development?and?characterization?of?248?novel?microsatellitemarkers?in?turbot，曾報道用構建大菱鲆微衛星富集文庫的方法篩選出248個微衛星位點，并設計了引物為構建遺傳連鎖圖譜提供條件，但未見對每個引物多態性情況的報道。

發明內容：

本發明的目的是提出一種自主構建大菱鲆基因富集文庫，并從中篩選出微衛星序列，在其兩端設計特異性引物進行PCR檢測，從而快速的檢測大菱鲆每個個體在微衛星區的遺傳變異，獲得該引物對大菱鲆多態性圖譜，通過圖譜檢測出每個個體的基因型，以期找到與該微衛星位點連鎖的性狀，為以后與傳統方法結合進行育種工作奠定基礎。

本發明是按照以下操作技術方案完成的：首先是提取大菱鲆基因組DNA并稀釋備用；再利用大菱鲆基因組文庫中的含有微衛星核心序列，在其兩端設計特異性引物；然后使用該引物對大菱鲆不同地理群體或同一群體中不同個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行檢測；利用產物出現的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得大菱鲆的遺傳多態性圖譜。

提取大菱鲆基因組DNA將其稀釋為50ng/ul，每個PCR反應中加入2ul，反應總體積為25ul。

FF0922微衛星核心序列及其兩端保守序列為：

1?ATGTGCTGTG?TCAGACTGTT?TATCTGTGAG?AAAACAGGCA?ATCAGAGAGG

51?GCGCTCACAT?ATTATTGAAA?TGACATGAAA?TCCATGTTAC?TCCACACTCA

101?AGTCGTATAT?GCAAGCTAGA?ATGGTGAATC?TCTTCTTGTC?TCCTACAGAC

151?AGACAAACAC?ACACACACAC?ACACACACAC?ACACACACAC?ACAAACACAT

201?ACACAAAACA?AGACCAACAG?TGACATGATA?TAACATGATC?ACCAAATCAC

251?AGAAACTGTA?GGGGAGAAGG?GGAAAAAAAG?CTAATAAAGC?TATAGCAAAA

301?TTAGAACTGT?GCTGTAGGCA?GATCCAGTGT?CTCCAGTAAT?CTACATAAGC

351?AGCAGTTGTC?GT；

根據其設計的特異性引物為：正鏈5’-TGTGAGAAAACAGGCAATC-3’負鏈5’-CAGTTTCTGTGATTTGGTGAT-3’，使用引物時退火溫度60℃。

PCR擴增的加樣參數為：每個PCR反應總體積為25ul，包括100ng大菱鲆基因組DNA；10×PCR?buffer，2.5ul；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶1U；dNTP各0.2mmol/L；本發明在FF0922微衛星核心序列兩端設計的引物各0.2umol/L；加ddH₂O至25ul。使用該引物時設置PCR儀的程序為94℃變性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30個循環；72℃延伸7min，4℃保存。