[發(fā)明專利]利用特異性引物對(duì)大菱鲆FF0922微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910230906.1
• 申請(qǐng)日: 2009-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN101705296A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬愛軍;侯仕營(yíng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 37101
• 代理人: 袁和善

1.一種利用特異性引物對(duì)大菱鲆FF0922微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于它的技術(shù)操作程序是：首先提取大菱鲆DNA；再利用大菱鲆基因組文庫中FF0922克隆的微衛(wèi)星DNA核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)大菱鲆不同地理群體或群體內(nèi)不同個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得大菱鲆FF0922核心序列區(qū)的遺傳多樣性變異圖譜；

所述的提取的大菱鲆基因組DNA，稀釋為50ng/ul，在其每個(gè)PCR反應(yīng)中加入2ul反應(yīng)總體積為25ul；

所述的PCR擴(kuò)增：其加樣參數(shù)為：每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為25ul，包括100ng大菱鲆基因組DNA；10×PCR?buffer，2.5ul；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶1U；dNTP各0.2mmol/L；FF0922微衛(wèi)星核心序列兩端設(shè)計(jì)的引物各0.2umol/L；加ddH₂O至25ul；使用該引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序?yàn)?4℃變性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存；

所述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)：將PCR產(chǎn)物在濃度為8％變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1-1.5小時(shí)進(jìn)行分離；將帶有PAGE膠的板放入濃度為10％冰醋酸溶液中搖動(dòng)至膠全部脫色；用超純水漂洗膠板2次；加入顯色液輕輕搖動(dòng)；用超純水快速?zèng)_洗膠板兩面以除去凝膠表面的染色液；將膠板快速轉(zhuǎn)移到冷卻的顯色液中直至帶紋出現(xiàn)；將膠板快速移動(dòng)到10％冰醋酸溶液中輕搖3-5min；用超純水清洗玻璃板；將膠板置于室溫下自然干燥；可得到大菱鲆FF0922基因座位的遺傳多態(tài)性圖譜；

其特征在于所述的：FF0922微衛(wèi)星核心序列及其兩端保守序列為：

1???ATGTGCTGTG?TCAGACTGTT?TATCTGTGAG?AAAACAGGCA?ATCAGAGAGG

51??GCGCTCACAT?ATTATTGAAA?TGACATGAAA?TCCATGTTAC?TCCACACTCA

101?AGTCGTATAT?GCAAGCTAGA?ATGGTGAATC?TCTTCTTGTC?TCCTACAGAC

151?AGACAAACAC?ACACACACAC?ACACACACAC?ACACACACAC?ACAAACACAT

201?ACACAAAACA?AGACCAACAG?TGACATGATA?TAACATGATC?ACCAAATCAC

251?AGAAACTGTA?GGGGAGAAGG?GGAAAAAAAG?CTAATAAAGC?TATAGCAAAA

301?TTAGAACTGT?GCTGTAGGCA?GATCCAGTGT?CTCCAGTAAT?CTACATAAGC

351?AGCAGTTGTC?GT；

其核心序列的特異性引物序列分別為：正鏈5’-TGTGAGAAAACAGGCAATC-3’，負(fù)鏈5’-CAGTTTCTGTGATTTGGTGAT-3’；該引物的退火溫度為60℃。