[發明專利]利用特異性引物對大菱鲆FF0901微衛星標記的檢測方法

無效

• 申請號: 200910230905.7
• 申請日: 2009-11-20
• 公開（公告）號: CN101705295A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 馬愛軍;侯仕營
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 袁和善

技術領域：

本發明屬于大菱鲆DNA分子遺傳標記技術，是一種檢測大菱鲆FF0901 微衛星標記技術方法。

背景技術：

本發明做出之前，國內外有類似的報道，國內中國水產科學院黃海水 產研究所陳松林等(Molecular?Ecology?Notes?2007)發表的Isolation?and characterization?of?polymorphic?microsatellite?loci?from?EST library?of?turbot(Scophthalmus?maximus)and?cross-species amplification，曾報道了大菱鲆部分微衛星位點的檢測方法，但大菱鲆基 因組文庫并非自己構建，而是從已有的報道里選取的；孫效文等(Conserv Genet?2009)發表的Isolation?and?characterization?of?microsatellite markers?for?turbo(Scophthalmus?maximus)by?screening?SSR-enriched library，曾報道了大菱鲆部分基因組文庫的構建、含微衛星序列的篩選 等內容，但其有的引物擴增出的序列等位基因太少，多態性不高，從而導 致應用時不能有效地區分不同群體或個體；西班牙Pardo等(Genome?2007) 發表的Development?and?characterization?of?248?novel?microsatellite markers?in?turbot，曾報道用構建大菱鲆微衛星富集文庫的方法篩選出 248個微衛星位點，并設計了引物為構建遺傳連鎖圖譜提供條件，但未見 對每個引物多態性情況的報道。

發明內容：

本發明的目的是提出一種自主構建大菱鲆基因富集文庫，并從中篩選 出微衛星序列，在其兩端設計特異性引物進行PCR檢測，從而快速的檢測 大菱鲆每個個體在微衛星區的遺傳變異，獲得該引物對大菱鲆多態性圖譜， 通過圖譜檢測出每個個體的基因型，以期找到與該微衛星位點連鎖的性狀， 為以后與傳統方法結合進行育種工作奠定基礎。

本發明是按照以下操作技術方案完成的：首先是提取大菱鲆基因組 DNA并稀釋備用；再利用大菱鲆基因組文庫中的含有微衛星核心序列，在 其兩端設計特異性引物；然后使用該引物對大菱鲆不同地理群體或同一群 體中不同個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行檢測；利 用產物出現的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得大菱鲆的遺 傳多態性圖譜。

提取大菱鲆基因組DNA將其稀釋為50ng/ul，每個PCR反應中加入2ul， 反應總體積為25ul。

FF0901微衛星核心序列及其兩端保守序列為：

??1?AGTCTAGAGA?CCGCCGCAGG?TTCCTGAGGG?AACTCAATCT?CTACTCTTCT

?51?TCAAATTCTA?GAGTGAAGAG?TCCACCTCTC?AGAGCTGAAC?ATATATATTG

101?TATTTACGCT?TCGCATCGCT?CATGAGGCGC?CTGTATTCAA?TGTGTGGTGA

151?ATCAATCACC?CGCACGCCAG?CTCCGTTTCA?CATCCTAACC?CACGTGTCTG

201?ACTCCTCTGT?CACAACTCAG?ACACACACAC?ACACACACAC?ACACACACAC

251?ACAGTCTCAC?CTGGAGCAAG?GTGCTGCCTC?CGTCTGGTGG?CCTGGCAAAG

301?CTAACTGTAG?CCTAGCATCC?CCGTTACTCC?ACTCGTTGGT?GCGCGCGGTT

351?GTTTCCTCTT?GTCCTTTCTT?TTCTTTTCTT?TTCTTTTCTT?CACGATAAAC

401?GAGT；

根據其設計的特異性引物為：正鏈5’-TTACGCTTCGCATCGCTCAT-3’， 負鏈5’-TGCCAGGCCACCAGACG-3’；使用引物時退火溫度60℃。