[發(fā)明專利]利用特異性引物對大菱鲆FF0901微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910230905.7
• 申請日: 2009-11-20
• 公開（公告）號: CN101705295A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬愛軍;侯仕營
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 37101
• 代理人: 袁和善

1.一種利用特異性引物對大菱鲆FF0901微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測方法，其 特征在于它的技術(shù)操作程序是：首先提取大菱鲆DNA；再利用大菱鲆基因 組文庫中FF0901克隆的微衛(wèi)星DNA核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引 物；然后使用該引物對大菱鲆不同地理群體或群體內(nèi)不同個體的基因組 DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；利用 產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，并獲得大菱鲆FF0901 核心序列區(qū)的遺傳多樣性變異圖譜；

所述的提取的大菱鲆基因組DNA，稀釋為50ng/ul，在其每個PCR反應(yīng) 中加入2ul反應(yīng)總體積為25ul；

所述的PCR擴增：其加樣參數(shù)為：每個PCR反應(yīng)總體積為25ul，包括 100ng大菱鲆基因組DNA；10×PCR?buffer，2.5ul；Mg²⁺，2mmol/L；Taq酶 1U；dNTP各0.2mmol/L；FF0901微衛(wèi)星核心序列兩端設(shè)計的引物各 0.2umol/L；加ddH₂O至25ul；使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序為94℃變 性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30個循環(huán)；72℃延伸 7min，4℃保存；

所述的PCR產(chǎn)物進行檢測：將PCR產(chǎn)物在濃度為8％變性聚丙烯酰胺凝 膠，12W恒功率電泳1-1.5小時進行分離；將帶有PAGE膠的板放入濃度 為10％冰醋酸溶液中搖動至膠全部脫色；用超純水漂洗膠板2次；加入顯 色液輕輕搖動；用超純水快速沖洗膠板兩面以除去凝膠表面的染色液；將 膠板快速轉(zhuǎn)移到冷卻的顯色液中直至帶紋出現(xiàn)；將膠板快速移動到10％冰 醋酸溶液中輕搖3-5min；用超純水清洗玻璃板；將膠板置于室溫下自然 干燥；可得到大菱鲆FF0901基因座位的遺傳多態(tài)性圖譜；

其特征在于所述的FF0901微衛(wèi)星的位點序列為：

??1??AGTCTAGAGA?CCGCCGCAGG?TTCCTGAGGG?AACTCAATCT?CTACTCTTCT

?51??TCAAATTCTA?GAGTGAAGAG?TCCACCTCTC?AGAGCTGAAC?ATATATATTG

101??TATTTACGCT?TCGCATCGCT?CATGAGGCGC?CTGTATTCAA?TGTGTGGTGA

151??ATCAATCACC?CGCACGCCAG?CTCCGTTTCA?CATCCTAACC?CACGTGTCTG

201??ACTCCTCTGT?CACAACTCAG?ACACACACAC?ACACACACAC?ACACACACAC

251??ACAGTCTCAC?CTGGAGCAAG?GTGCTGCCTC?CGTCTGGTGG?CCTGGCAAAG

301??CTAACTGTAG?CCTAGCATCC?CCGTTACTCC?ACTCGTTGGT?GCGCGCGGTT

351??GTTTCCTCTT?GTCCTTTCTT?TTCTTTTCTT?TTCTTTTCTT?CACGATAAAC

401??GAGT；

其核心序列的特異性引物序列為，正鏈5’-TTACGCTTCGCATCGCTCAT -3’，負(fù)鏈5’-TGCCAGGCCACCAGACG-3’；該引物的退火溫度為60℃。