[發(fā)明專利]人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系及其建立方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910223844.1
• 申請日: 2009-11-24
• 公開（公告）號: CN102071168A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閆明霞;姚明;劉蕾;趙方瑜;朱淼鑫;王曉敏;孔韓衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;A01K67/027;C12R1/91
• 代理公司: 上海天翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 陳學(xué)雯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及癌細(xì)胞系，具體涉及人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系及其建立方法，屬于動物細(xì)胞系的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移時惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特性之一，原發(fā)性腫瘤致死是較為罕見的，90％以上腫瘤患者的死于腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)移時。

乳腺癌是危害女性身心健康的主要疾病之一，成為女性最常見的惡性腫瘤。在美國，每年有4.5萬名乳腺癌患者因腫瘤遠處轉(zhuǎn)移而死亡。

然而目前腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機制尚不十分清楚，關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移一直是腫瘤學(xué)研究的熱點。在有關(guān)乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移研究中，MDA-MB-435是較為常用的人乳腺癌細(xì)胞株。文獻報道，裸鼠乳腺癌脂肪墊原為接種該細(xì)胞4周、8周和12周時，鼠肺的轉(zhuǎn)移率分別是30％、70％和100％。由此可見，雖然該細(xì)胞株最終可以有較高的肺轉(zhuǎn)移率，但需要較長的實驗周期和較高的實驗投入。所以在本領(lǐng)域的研究中較大的局限性，制約了對乳腺癌轉(zhuǎn)移機制的研究的進展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞系，以解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的諸多不足之處，如人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435實驗周期較長和實驗投入較高的缺陷。

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

作為本發(fā)明的第一方面，一種人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系是MDA-MB-231sci，具有生物學(xué)和病理學(xué)特征，還具備特殊轉(zhuǎn)移表型。

所述生物學(xué)特征是，

MDA-MB-231sci細(xì)胞為典型的多邊形上皮樣細(xì)胞；

胞漿豐富，胞核大而圓，保持了MDA-MB-231細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)特點；

貼壁生長，大小較一致，排列緊密，界線清楚。

所述病理學(xué)特征是所述轉(zhuǎn)移使用裸鼠，所述裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞與皮下腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似，轉(zhuǎn)移時間縮短，轉(zhuǎn)移率高。

所述轉(zhuǎn)移時間縮短至26-42天。

所述裸鼠轉(zhuǎn)移率為100％。

人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系MDA-MB-231sci，包藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏地址：中國湖北省武漢市武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院武漢市武昌珞珈山，郵編430072。保藏日期2009年7月29日。保藏編號CCTCC?NO：C200955。

作為本發(fā)明的第二方面，人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系(MDA-MB-231sci)的建立方法，其特征在于，

(1)人乳腺癌原位移植瘤模型的建立：取裸小鼠5只，收集體外培養(yǎng)生長旺盛的連續(xù)傳代人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×10⁷個，每只小鼠取0.2ml接種于裸小鼠右背側(cè)近腋部皮下；

當(dāng)移植瘤長至直徑15mm左右時，頸椎脫臼法處死小鼠，剝?nèi)〕鲆浦擦?，清除外周血塊及結(jié)締組織，用含抗菌素的生理鹽水沖洗，切取生長良好、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，將其剪切成直徑約1.5mm的小塊，用20號套管針移植至另外裸小鼠右前側(cè)乳腺脂肪墊部位，建立乳腺癌原位移植瘤模型；

(2)原位移植肺靶向轉(zhuǎn)移模型的篩選：建立原位移植瘤模型后，待瘤徑長至1.5～2.0cm時手術(shù)切除腫瘤及相應(yīng)乳腺，待動物處于瀕死狀態(tài)時犧牲小鼠進行系統(tǒng)解剖，取肉眼明顯可見的肺轉(zhuǎn)移灶移植至另外裸小鼠乳腺脂肪墊進行原位移植，按乳腺原位移植、手術(shù)切除腫瘤及相應(yīng)乳腺、肺轉(zhuǎn)移灶、乳腺原位移植的體內(nèi)篩選方式進行高轉(zhuǎn)移循環(huán)篩選；

原代10只裸小鼠，其他每代4～6只裸小鼠，循環(huán)篩選至肺轉(zhuǎn)移達100％，此時取腫瘤組織建立相應(yīng)的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系；

(3)人乳腺癌肺靶向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的建立及傳代：將荷瘤裸小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出皮下移植瘤，剔除壞死組織、纖維包膜及血管；

用含雙抗的PBS洗2次，向組織滴1-2滴含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用顯微剪刀和顯微鑷將其盡量剪成小塊；

用顯微鑷將剪切好的組織塊在6cm培養(yǎng)皿上均勻放置，每一小塊間距0.5cm左右；

然后在培養(yǎng)皿內(nèi)注入適量培養(yǎng)液，放置在37℃、含5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)。以后所建立的原代細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。

所述步驟(2)中所述循環(huán)篩選至第四代時肺轉(zhuǎn)移達100％，同時伴部分動物腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明采用體內(nèi)篩選每代手術(shù)切除腫瘤及相應(yīng)乳腺，提高成功率。

2、本發(fā)明的轉(zhuǎn)移率提高達100％，同時伴部分動物腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

附圖說明

以下結(jié)合附圖和具體實施方式來進一步說明本發(fā)明。

圖1為乳腺癌原位移植瘤模型的照片。