[發明專利]一種谷氨酰胺轉胺酶發酵過程中補料的方法

有效

• 申請號: 200910223521.2
• 申請日: 2009-11-23
• 公開（公告）號: CN101698836A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;陳康康;張東旭;李江華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12R1/55
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及發酵過程中的補料方法，尤其是一種提高谷氨酰胺轉胺酶發 酵過程中溶氧的補料方法。

背景技術

微生物谷氨酰胺轉胺酶(蛋白質-谷氨酸-谷氨酰胺轉胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13簡稱MTG)其生物學功能是直接改變蛋白質 本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白 質的營養價值。因此，MTG在食品、紡織、生物制藥等領域有著廣泛的應 用前景。在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產谷氨酰胺轉胺酶的菌株 (Streptomyces?hygroscopicus?CCTCC?No.M203062)，對其進行了發酵條 件優化以及探討了MTG由酶原到成熟酶的活化機制。研究室的前期研究結 果表明，MTG在營養菌絲的的生長階段并不分泌，而是在分化形成氣生菌 絲時才開啟動和分泌，因此提高菌體量，對于促進產酶有很重要的作用。

流加技術是能控制或改變培養基中的一種或一種以上的營養成分的濃 度，這樣在細胞生長或產物形成對底物濃度受限敏感的工藝過程中使用比 較理想，還可以做到用較確定的營養成分來代替復雜的營養源流加培養是 提高菌體濃度的傳統方法。對于利用補料發酵生產MTG，已有報道(許曉 娟.吸水鏈霉菌發酵生產谷氨酰胺轉胺酶的補料研究.中國生物工程雜志， 2009，29(5)：78-82)，通過流加碳源提高酶的產量，取得一定效果，但是該 方法存在一個問題，補加碳源導致發酵液黏度較大，溶氧水平較低，限制了 菌體的生長和產酶。本發明利用補料的方式降低發酵液黏度，未見文獻報道。

發明內容

針對谷氨酰胺轉胺酶發酵過程中溶氧較低的問題，本發明所要解決的技 術問題是提供一種谷氨酰胺轉胺酶發酵過程中補料的方法，提高了菌體的生 物量和谷氨酰胺轉胺酶的產量。

為解決上述問題，本發明提供的谷氨酰胺轉胺酶發酵過程中補料的方 法，是在菌體生長期流加碳源和有機氮源的混合液；谷氨酰胺轉胺酶發酵過 程中，單獨流加碳源提高菌體的生物量，單獨流加有機氮源避免谷氨酰胺轉 胺酶將發酵液中未利用的氮源交聯，導致發酵液粘稠，將這兩種技術結合， 提高了發酵液中溶氧水平，菌體生物量和谷氨酰胺轉胺酶的產量都相應提 高。

本發明技術方案的原理如下：在吸水鏈霉菌發酵過程中，谷氨酰胺轉胺 酶會使發酵液中蛋白質氮源交聯，導致發酵液黏稠，嚴重的影響了溶氧水平， 對于微生物生長有很大影響，進而影響酶的產量。本發明通過降低初始發酵 培養基中的氮源濃度，減輕了因蛋白質氮源作為反應底物被交聯而引起的發 酵液粘稠現象，通過流加氮源、碳源的方法為菌體生長和產酶提供營養。發 酵前期，營養菌絲生長，MTG并不分泌，8小時后，菌體開始分泌谷氨酰 胺轉胺酶，在此期間通過流加一定碳氮比的營養液的方法，提高菌體生長期 溶氧水平及底物利用效率，提高MTG產量。

所述的方法中，生產菌株可為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、茂原鏈霉菌(Streptoverticilluim?mobaraense)，其中優選 菌為吸水鏈霉菌菌種(Streptomyces?hygroscopicus)由武漢中國典型培養物 保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC?No.M203062，該菌種在(谷氨酰胺轉 胺酶高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產谷氨酰胺轉胺酶，專利號 ZL03152956.9)中公開。

所述的方法中，微生物優選培養基為：斜面培養基(g/L)，麥芽汁50(10 oBe)，酵母膏5，葡萄糖5，瓊脂20，pH?7.0；種子培養基(g/L)，玉米淀粉 20，蛋白胨20，酵母膏5，無水硫酸鎂2，磷酸氫二鉀2，無水磷酸二 氫鉀2，pH7.0；初始發酵培養基(g/L)，葡萄糖10，蛋白胨10g，酵母膏5g， 無水硫酸鎂2g，磷酸氫二鉀3.75g，無水磷酸二氫鉀0.25g，碳酸鈣5g， pH8.0。

所述的方法中，微生物培養條件為，接一鏟生長良好的斜面培養物至裝 有100mL種子培養基的500mL三角瓶中培養，搖瓶轉速為200r/min，溫 度32℃，培養時間24h。以6％的接種量接入3L全自動發酵罐(LiFlus?GM BioTRON，Korea)中，裝液量為1.5L，設定通氣量1.25vvm，攪拌轉速700 r/min，溫度控制在32C，對發酵過程的pH不進行控制。