[發明專利]用金屬氧化物富集糖肽及同時富集糖肽和磷酸化肽的方法

有效

• 申請號: 200910220155.5
• 申請日: 2009-11-25
• 公開（公告）號: CN102070701A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 梁鑫淼;閆競宇;柯燕雄;李秀玲;張秀莉;薛興亞
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K2/00
• 分類號: C07K2/00;C07K1/14;C07K1/16;C07K1/34
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

技術領域

本發明涉及糖肽和磷酸化肽的分離與純化，具體地說是一種利用金屬氧化物富集糖肽以及同時富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。

技術背景

翻譯后蛋白質的修飾是蛋白質組學中的研究熱點課題，尤其是蛋白質的磷酸化和糖基化，是存在最為普遍，研究最為廣泛的兩種翻譯后修飾過程。蛋白質的磷酸化幾乎調控生命的整個過程，包括細胞的增殖，發育和分化，也是目前所知道的信號的主要傳遞方式之一。同時，了解蛋白質的糖基化過程，對一些如癌癥炎癥等疾病的診斷和治療都是具有非常重要的意義。目前，對于蛋白質翻譯后修飾過程的研究一個非常重要的手段就是利用生物質譜解析蛋白質的肽段結構，但由于糖基化和磷酸化肽段離子化效率較低，質譜信號常常受到非修飾肽段的抑制，嚴重干擾對修飾肽段的檢測。因此，在質譜分析前對磷酸化和糖基化肽段的富集是非常必要的[Liu，X.；Ma，L.；Li，J.J.Anal.Lett.2008，41，268；Morelle，W.；Canis，K.；Chirat，F.；Faid，V.；Michalski，J.C.Proteomics?2006，6，3993]。

近年來，很多富集糖肽的方法被提出和應用。最為常見的就是凝集素的方法，這種方法的選擇性較好，但同時存在著通用性不強的缺點，尤其在處理復雜樣品時很可能會丟失不能與凝集素特異性結合的糖肽[J.Glycoconjugate?J.2004，21，35；Kubota，K.；Sato，Y.；Suzuki，Y.et?al.Anal：Chem.2008，80，3693]；化學方法如肼化學可以選擇性的富集糖肽，但是這種方法丟失糖鏈的信息[Zhang，H.；Li，X.J.；Martin，D.B.；Aebersold，R.Nat.Biotechnol.2003，21，660.]；親水作用色譜也能夠用來富集極性相對較大的糖肽，但是容易受到具有相當極性的非糖肽的干擾[Wada，Y.；Tajiri，M.；Yoshida，S.Anal.Chem.2004，76，6560.]；硼酸能與順勢二醇形成硼酸酯結構也可以用來綁定糖肽，但這種方法的費時較長[Zhou，W.；Yao，N.；Yao，G.P.；Deng，C.H.；Zhang，X.M.；Yang，P.Y.Chem.Commun.2008，5577.]；石墨化碳與極性的糖肽發生偶極相互作用而加強對糖肽的保留，但是不適用于具有較長肽段的糖肽。總之。目前還未見一種操作簡單通用性強的富集方法來選擇性的富集糖肽。用金屬氧化物作為富集材料對糖肽進行富集目前未見報道。

相較于糖肽的富集磷酸化肽的富集近年來發展迅速，以氧化鈦為代表的金屬氧化物，在磷酸化肽富集方面展現了其選擇性高特異性好的特點[Pinkse，M.W.H.；Uitto，P.M.；Hilhorst，M.J.；Ooms，B.；Heck，A.J.R.Anal.Chem.2004，76，3935；Larsen，M.R.；Thingholm，T.E.；Jensen，O.N.；Roepstorff，P.；Jorgensen，T.J.D.Mol.Cell.Proteomics?2005，4，873.]，已經被廣泛的應用到磷酸化蛋白質組學中。但是，用金屬氧化物在一次操作中同時得到糖肽和磷酸化肽還未見報道。

發明內容

為解決上述難點，發明人通過研究氧化鈦微球對單糖和寡糖的色譜保留行為發現，糖在氧化鈦色譜柱上有很強的保留，這種保留隨糖鏈的增長而增強，隨流動相酸性添加劑的濃度增加而減少。發明人將氧化鈦微球的這個性質用于進行糖肽的富集，通過對結構明確的標準糖蛋白的酶解液在不同條件下洗脫糖肽和非糖肽，實現了對糖肽的選擇性富集。同時，由于氧化鈦可以同時保留糖肽和磷酸化肽，通過在酸性條件下洗脫糖肽，在堿性條件下洗脫磷酸化肽，實現了糖肽和磷酸化肽的同時富集。

用金屬氧化物富集糖肽及同時富集糖肽和磷酸化肽的方法，以金屬氧化物作為固相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同時富集磷酸化肽和糖肽。

所述金屬氧化物為氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁中的一種或多種復合金屬氧化物；金屬氧化物材料形態為納米材料、微球材料以及金屬氧化物涂覆或包覆的球形或無定形材料。

所述富集的過程為柱萃取，具體操作如下：

1)將金屬氧化物裝入萃取柱管中，將pH為5-8蛋白酶解物上樣到萃取柱中，蛋白酶解物與金屬氧化物材料的重量比例為1∶1～200；

2)分別用1～10倍柱體積的鹽溶液、1～10倍柱體積的含有有機酸的乙腈水溶液沖洗萃取柱，乙腈的體積濃度為0-95％；