[發明專利]一種微囊化細胞活性的檢測方法

有效

• 申請號: 200910219620.3
• 申請日: 2009-11-04
• 公開（公告）號: CN102053123A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發明（設計）人: 馬小軍;肖靜;王為;于煒婷
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N1/28;G01N30/06;C12Q1/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

技術領域

本發明涉及細胞活性的檢測方法，具體地說是一種通過能荷計算表征微囊化細胞活性的檢測方法。

背景技術

微囊化細胞培養作為一種大規模細胞培養技術，因其特殊微囊環境能使細胞呈現三維立體生長而在單克隆抗體生產、細胞移植及細胞擴增等領域具有廣泛應用。

培養過程中微囊化細胞活性直接影響下游產率和應用效果。目前采用噻唑藍(MTT)法對微囊化細胞活性進行檢測。該方法是利用胞內線粒體琥珀酸脫氫酶將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，再用二甲基亞砜(DMSO)溶解結晶，測定溶液光吸收值作為細胞活性的指標。MTT法作為一種基于低細胞密度、單層培養體系建立的檢測方法，雖然在常規細胞培養中廣泛應用，但未考慮微囊特殊環境中，細胞三維生長模式對MTT進入胞內和甲瓚產物充分溶出造成障礙，對實驗結果準確性產生影響。

腺苷酸作為細胞直接能量物質，和細胞生存代謝狀態緊密相關，通過檢測胞內腺苷酸種類及含量的變化，可達到對微囊化細胞活性檢測的目的。

腺苷酸常見提取方法為酸抽提，即在待測物中加入酸性物質沉淀蛋白后，通過反復離心獲取上清中腺苷酸，再用堿中和進行下游檢測。但該抽提方法不適用于特殊的微囊化細胞的培養體系，原因如下：1、抽提過程PH變化影響腺苷酸穩定性，造成部分產物分解而使檢測結果低于實際值；2、微囊材料和酸的相互作用，降低提取效率。

針對上述問題，本專利設計了一套適用于微膠囊培養體系的腺苷酸抽提方案，發明了以胞內腺苷酸種類數量變化及能荷變化表征微囊內細胞活性的方法，達到對微囊化細胞活性檢測的目的。

發明內容

本專利設計了一套適用于微膠囊培養體系的腺苷酸抽提方案，發明了以胞內腺苷酸種類數量變化及能荷變化表征微囊內細胞活性的方法，達到對微囊化細胞活性檢測的目的。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

將待分析的微囊化細胞樣品機械破囊處理后，加入預熱的裂解液中孵育裂解蛋白后，上清液采用高效液相色譜法分離定量腺苷酸，計算能荷，以腺苷酸種類數量變化以及能荷變化作為評價微囊化細胞活性的指標。具體為：

1)樣品制備：

A：裂解液：45-55mM?HEPES(PH7.0-7.5)，10-80mAU/ml蛋白酶k(提取DNA用的商品化蛋白酶)，50-80℃水浴預熱。

B：收集微囊化培養的貼壁細胞或懸浮細胞，濾除培養液，預冷PBS清洗至洗液無色后濾干液體。采用機械破囊法，將樣品轉移至注射器中，反復抽吸研磨破囊。顯微鏡下見微囊膜全部破損后，加入預熱裂解液，30-80℃水浴孵育15-45分鐘，5分鐘間隔震蕩，再將反應體系轉移至30-80℃水浴繼續反應15-45分鐘，過濾收集上清液；

2)腺苷酸分離定量：

采用高效液相色譜法對提取樣品中腺苷酸進行分離含量。測定條件為紫外檢測器，波長260nm，C18反相柱，流動相為PH＝7.0-7.5、50-200mM的K₂PO4，3-10mM的TBABr，流速0.5-1.0ml/min。分離定量ATP、ADP、AMP，計算單位細胞產物含量。按照能荷＝([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])計算細胞能荷。

其中，能荷＜0.5表明細胞已經走向凋亡；能荷＞0.5表明細胞存活，且數值越高細胞活性越好。

本發明與現有技術相比具有以下優點：由于本發明所檢測的是全細胞裂解液中腺苷酸的含量，且利用高效液相色譜進行分離定量，可避免由于微囊材料以及不同細胞生長方式對實驗結果的影響，適用于多種材料制備的微囊，包括海藻酸鈉、殼聚糖、明膠、聚乳酸等；檢測過程不添加任何有機試劑，具有測定方法穩定、測定結果可靠等優點。本發明適用于貼壁培養或懸浮培養的動物細胞、植物細胞以及微生物細胞。測定結果能正確反映細胞的活性，對微囊化細胞的應用研究有指導意義。

附圖說明

圖1為本發明實施例1不同培養時間海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊化細胞能荷變化曲線，可見隨著培養時間延長，微囊中細胞能荷值逐漸降低，能荷低于0.5時，預示細胞出現凋亡。

圖2為本發明中抽提方法(NEW)和酸法抽提(PCA)的比較，可見本發明樣品損失小，抽提效率更高。

具體實施方式

實施例1

一種通過能荷表征微囊化細胞活性的檢測方法

1)樣品制備：

A：裂解液：50mM?HEPES，(PH7.4)，50mAU/ml蛋白酶k，50℃水浴預熱。