[發明專利]醫用級Ⅲ型膠原的制備方法

無效

• 申請號: 200910216686.7
• 申請日: 2009-12-11
• 公開（公告）號: CN101717804A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 蔣波;李霞;陳露;萬法盛
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K14/78;A61K38/39;A61L27/24
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司 51202
• 代理人: 鄧繼軒

1.一種醫用級III型膠原的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

(1)、新生犢牛皮的前處理

將新鮮新生犢牛皮刮去毛和毛囊，去皮下組織和脂肪后細切，取300g切細的皮加入 醇∶鹵代烷＝1.5體積比的混合溶液5000ml，浸泡脫脂，每隔15小時更換一次上述溶液， 45小時倒掉溶液；用濃度為98％的乙醇水溶液5000ml浸泡，15小時更換一次，30小時倒 掉溶液；用濃度為20％的乙醇水溶液5000ml清洗一次；再用0.2mol/L?EDTA溶液，pH＝10.5 ～11.5，于溫度6℃浸泡12小時，然后，用超純水5000ml洗滌3次；再用濃度為30％的 NaCl水溶液5000ml浸泡，6小時更換一次，12小時倒掉溶液，用超純水5000ml清洗2 次，再將牛皮置入5000ml超純水中浸泡過夜，將水倒掉；

(2)、胃蛋白酶酶解

在上述固體物質中，加入濃度為0.6mol/L的醋酸水溶液5000ml，然后加入胃蛋白酶 0.3g，置于溫度4℃冰箱中放置7天，每天搖動2次，用堿溶液調節溶液至pH＝8-8.5，放 置過夜，再用酸溶液調節溶液至pH＝2-2.5，放置過夜，離心取上清液，去皮渣；

(3)、鹽析

在上述清液中加入固體NaCl至濃度為25％，加完后置于4℃冰箱中放置過夜，離心取固 體物質放入透析袋中以去離子水透析，脫鹽，或者將上述清液用濃度為0.02mol/L的 Na₂HPO₄溶液5000ml充分透析72小時，24小時更換一次，72小時后離心收集透析袋內固體 物質用濃度為0.5mol/L的醋酸水溶液5000ml透析，溶解，再用去離子水透析，脫鹽；

將脫鹽后的物質懸浮于濃度為1.5mol/L?NaCl、0.05mol/L?Tris，pH＝7.5的緩沖液5000ml 中，攪拌24小時，離心取固體物質，去上清液，將固體物質按上述方法重復純化5次；

(4)、變性-復性

將上述固體物質放入濃度6mol/L鹽酸胍、0.05mol/L?Tris-HCl，pH＝7.5的緩沖液 1000ml中，溶解，在溫度90℃水浴中加熱60分鐘，室溫下，離心取上清液，用5000ml室 溫超純水透析6小時，換水2次，高速離心分離，取固體物質，離心機轉速為20000r/min， 時間為60min，溫度為6℃，獲得III型膠原，產率為0.50％。