[發明專利]殼聚糖溶液、其制備方法以及應用方法

有效

• 申請號: 200910211251.3
• 申請日: 2009-11-05
• 公開（公告）號: CN101698712A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發明（設計）人: 王健偉;鐘輝
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院病原生物學研究所
• 主分類號: C08L5/08
• 分類號: C08L5/08;C08J3/02;C12N15/861
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明涉及高分子物質、物理化學、分子生物學、病毒學領域。具體而言，本發明涉及殼聚糖溶液、其制備方法以及應用其促進腺病毒載體介導的基因轉導效率的方法。?

背景技術

殼聚糖為甲殼素脫乙酰基后的產物，去乙酰程度可以為65％～100％。殼聚糖是目前已知的唯一的陽離子多糖，不溶于水和有機溶劑，可溶于pH＜6.5的稀酸，包括己二酸、鹽酸、醋酸、甲酸、乳酸、蘋果酸、丙酸和琥珀酸等。殼聚糖具有無毒、生物相容性良好和生物可降解的特點，因此在食品、醫藥及生物等領域應用廣泛。?

雖然殼聚糖具有無毒、生物相容性良好和生物可降解的優點，但是殼聚糖僅溶于部分酸性溶液，并在pH6.5以上的液體中不溶。由于絕大部分細胞均不能很好的耐受酸性環境，因此直接給予酸性殼聚糖溶液容易導致細胞損傷。而且機體內環境的pH值為7.4，在此條件下直接給予酸性殼聚糖將會被很快被機體中和至中性pH值，其中的殼聚糖將會形成沉淀，失去其生物學活性。此外在某些制藥或生物工程過程中可能需要特殊的堿性反應條件，而殼聚糖在堿性條件下不溶將會導致相應的反應變得十分困難甚至不可能。因此改善殼聚糖的溶解性將有助于擴大殼聚糖的pH適應范圍，為其更為廣泛的應用提供了可能性。?

目前中性或堿性條件下溶解殼聚糖的方法均為對殼聚糖進行化學基團的修飾，費時費力且難以操作。已有多篇報道稱可以通過設計多種溶解性良好的殼聚糖的衍生物來實現溶解，并研究了其生物學性質。所述衍生物包括三甲基殼聚糖、PEG化殼聚糖和50％去乙酰化殼聚糖?等。與未改造殼聚糖相比，三甲基殼聚糖在生理pH條件下Zeta電位高、DNA濃縮效果好、基因轉導效率較高，但是其細胞毒性明顯增大，而未改造的殼聚糖在酸性條件下才具有良好的DNA濃縮效果，在生理pH條件下其Zeta電位降低，DNA濃縮效果下降，DNA的轉導效率也降低；PEG化對陽離子聚合物的DNA濃縮活性和細胞攝入效率有明顯的干擾作用；去乙酰化為50％的殼聚糖水溶性很好，但是其基因轉導效率低下。最近有關對自分支糖基化殼聚糖寡聚體的研究報道表明，該化合物具有水溶性好、無毒和基因轉導效率較高的優點，但其化學合成過程十分復雜。這些缺點均阻礙了殼聚糖在促進基因轉導效率中的應用。?

本發明創新性在于采用了尋找合適化學物質促溶的思路，采用一種極其簡單的方法實現了殼聚糖在pH6.8～pH14.0范圍內的溶解，具有簡單和易操作的特點。?

重組腺病毒載體(rAdv)具有基因轉導效率高、病毒載體滴度高以及能感染非復制相細胞等多種優點，因此在一過性、高水平的轉基因表達具有特別的優勢。以人類腺病毒為基礎的載體已經在基礎科研、基因治療、基因疫苗領域中被廣泛應用于不同細胞系的基因轉導。由Journal?of?Gene?Medicine提供的全球基因治療臨床試驗數據庫顯示，截止到2009年4月，在全球范圍內已有的1537個基因治療臨床試驗中，應用重組腺病毒載體的試驗為375例，約占24％，在各種應用載體中所占比例最高。目前絕大部分在體和離體應用的腺病毒載體均是基于5型腺病毒。?

雖然重組腺病毒載體已得到廣泛應用，但由于rAdv的基因轉導主要是通過柯薩奇病毒-腺病毒受體(CAR)介導，導致rAdv對CAR受體表達缺失的細胞的基因轉導效率低下。因此開發非CAR受體依賴的、高效、低毒及簡單易行的促進rAdv基因轉導效率的方法十分必要。?

已有多種研究試圖從不同方向或者通過不同策略來提高rAdv在CAR受體缺失細胞系上的基因轉導效率，包括采用新的血清型腺病毒載體或變換腺病毒載體外殼蛋白、腺病毒載體的PEG化、不陽離子脂質體以及陽離子聚合物包裹等。?

不同血清型的腺病毒載體的細胞受體各不相同，因此采用不同血?清型的腺病毒載體將有助于提高腺病毒載體對CAR表達缺失細胞的基因轉導效率。但是目前5型外其他血清型的腺病毒載體尚不成熟，其應用的有效性和安全性尚有待評價。改變腺病毒外殼蛋白也可以改變腺病毒載體的細胞親嗜性，提高其對CAR表達缺失細胞的轉導效率。但是上述方法均是通過配體-受體系統進入細胞，因此其效率仍然受到相應細胞表面受體表達量的影響。?