[發明專利]海產貝類中病毒的濃縮方法及病毒濃縮回收率的測定方法

無效

• 申請號: 200910211150.6
• 申請日: 2009-11-06
• 公開（公告）號: CN102051346A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發明（設計）人: 樊景鳳;明紅霞;吳利軍;陳佳瑩;李利利;付慧
• 申請（專利權）人: 國家海洋環境監測中心
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所 11216
• 代理人: 劉激揚

技術領域

本發明涉及海產貝類中病毒的濃縮方法，具體涉及到海產貝類中病毒的濃縮方法和貝類體內甲型肝炎病毒(Hepatitis?A?viruses，HAV)濃縮方法的回收率測定。

背景技術

貝類是富集病毒的重要載體，以往的研究是通過細胞培養來進行病毒的增殖和檢測，但是細胞培養的方法不但耗時耗資，并且許多病毒找不到合適的細胞系進行培養，致使貝類體內許多病毒的研究滯后。PCR方法的應用解決了上述難題，但是在病毒的檢測過程中又經常出現兩種問題：一是由于含量太低而不能直接被檢測到，二是必須除去或者盡量減少在RT-PCR反應過程中的RNA抑制劑，發明一種貝類體內病毒的濃縮方法是十分必要的。

貝類中的病毒濃縮是一個理化過程，常用的貝類濃縮方法一是沉淀法，organic-occulation(OF)和PEG是兩種常用的絮凝劑，是具有強烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，此方法首先要改變樣品pH值(硼酸鹽、甘氨酸、牛肉膏、牛肉膏-二氯二氟是四種常用的緩沖液)，使病毒粒與樣品微粒分開，利用OF和PEG把病毒粒沉淀下來，最終通過氯仿抽提的方法將病毒抽提出來。有學者比較這四種緩沖液和OF、PEG-6000和PEG-8000三種絮凝劑，得出四種緩沖液對濃縮效率沒有多大影響，這三種絮凝劑中PEG-8000的濃縮效率最高，但是該方法在透析之后需要洗膜，并且需要過夜處理，既費時工作量又大，所以在處理大批樣品時該方法并不實用。近來又有學者提出將PEG和Pro-cipitate兩種透析方法同時使用，該方法濃縮效率較高，但是比PEG-8000方法更耗時。第二種常用的方法是差速離心，此方法通過調節pH和離心速度來達到將病毒粒子和組織分開的目的，但是該方法獲得的最終產物中抑制劑比較多。本方法綜合了上述兩種方法的優點，在差速離心的基礎上再進行氯仿抽提，既節約了時間又提高了濃縮效率。

發明內容

本發明提供一種海產貝類中病毒的濃縮方法，該方法包括：取25g貝肉組織于勻漿器中快速勻漿，將勻漿液放入50mL的滅菌離心管中并加入等體積的甘氨酸緩沖液(pH9.0)；調整pH至7.2±0.4，室溫條件下震蕩30min左右，4℃條件下，5,000×g離心15min，取上清液；上清液于4℃條件下，10,000×g離心1h，再次收集上清液；上清液在超速離心機中140,000×g離心1.5h，棄上清；沉淀用1mL?PB?S(pH7.4)重懸，以溶解沉淀；將重懸液加入一個2mL的滅菌離心管中并加入等量體積的氯仿，震蕩30min，然后4,000×g離心30min；吸取上清液，上層液相即為病毒抽提樣，得到約500μL濃縮樣品，凍存備檢。

本發明還提供一種海產貝類中病毒濃縮回收率的測定方法，該方法包括：

(1)取2mL的病毒減毒活疫苗添加到25g勻漿的貝肉中，作為試驗樣品，用病毒減毒活疫苗作為濃縮前的陽性對照，用未添加病毒減毒活疫苗的貝肉樣品作為陰性對照；

(2)用上述濃縮方法將添加病毒減毒活疫苗的貝肉和未添加病毒減毒活疫苗的貝肉進行濃縮，得到濃縮樣品；

(3)采用Trizol的方法進行貝類體內病毒RNA的提取；

(4)病毒PCR引物設計位于HAV基因組中編碼V1-V3衣殼蛋白的區域，目的片段長度為76bp；

(5)病毒標準曲線的建立，用EASY-Dillution將已知拷貝數的重組質粒作10²～10⁷6個梯度的稀釋；

20μL?RT-PCR反應體系為：10.0μL的SYBR?Premix?Ex?Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX?Reference?Dye?II(50×)、質粒模板2.0μL和滅菌水6.8μL；

反應條件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40個循環，熔解曲線分析條件為95℃10s，60℃1min，95℃15s；

(6)根據標準曲線計算樣品中病毒的拷貝數，從而計算貝類樣品中病毒的回收率。

在上述方法中，病毒的實例為甲型肝炎病毒。

附圖說明

圖1是HAV實時定量RT-PCR標準曲線圖；

圖2是HAV實時定量RT-PCR擴增曲線圖；

圖3是HAV實時定量RT-PCR熔解曲線圖。

具體實施方式

(一)濃縮方法：

1、取25g貝肉組織于勻漿器中快速勻漿，將勻漿液放入50mL的滅菌離心管中并加入等體積的甘氨酸緩沖液(pH9.0)；