[發明專利]海產貝類中病毒的濃縮方法及病毒濃縮回收率的測定方法

無效

• 申請號: 200910211150.6
• 申請日: 2009-11-06
• 公開（公告）號: CN102051346A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發明（設計）人: 樊景鳳;明紅霞;吳利軍;陳佳瑩;李利利;付慧
• 申請（專利權）人: 國家海洋環境監測中心
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所 11216
• 代理人: 劉激揚

1.一種海產貝類中病毒的濃縮方法，該方法包括：

取25g貝肉組織于勻漿器中快速勻漿，將勻漿液放入50mL的滅菌離心管中并加入等體積的甘氨酸緩沖液(pH9.0)；調整pH至7.2±0.4，室溫條件下震蕩30min左右，4℃條件下，5,000×g離心15min，取上清液；上清液于4℃條件下，10,000×g離心1h，再次收集上清液；上清液在超速離心機中140,000×g離心1.5h，棄上清；沉淀用1mL?PBS(pH7.4)重懸，以溶解沉淀；將重懸液加入一個2mL的滅菌離心管中并加入等量體積的氯仿，震蕩30min，然后4,000×g離心30min；吸取上清液，上層液相即為病毒抽提樣，得到約500μL濃縮樣品，凍存備檢。

2.海產貝類中病毒濃縮回收率的測定方法，該方法包括：

(1)取2mL的病毒減毒活疫苗添加到25g勻漿的貝肉中，作為試驗樣品，用病毒減毒活疫苗作為濃縮前的陽性對照，用未添加病毒減毒活疫苗的貝肉樣品作為陰性對照；

(2)用權利要求1所述的濃縮方法將添加病毒減毒活疫苗的貝肉和未添加病毒減毒活疫苗的貝肉進行濃縮，得到濃縮樣品；

(3)采用Trizol的方法進行貝類體內病毒RNA的提取；

(4)病毒PCR引物設計位于HAV基因組中編碼V₁-V₃衣殼蛋白的區域，目的片段長度為76bp；

(5)病毒標準曲線的建立，用EASY-Dillution將已知拷貝數的重組質粒作10²～10⁷6個梯度的稀釋；

20μL?RT-PCR反應體系為：10.0μL的SYBR?Premix?Ex?Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX?Reference?Dye?II(50×)、質粒模板2.0μL和滅菌水6.8μL；

反應條件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40個循環，熔解曲線分析條件為95℃10s，60℃1min，95℃15s；

(6)根據標準曲線計算樣品中病毒的拷貝數，從而計算貝類樣品中病毒的回收率。

3.根據權利要求2所述的病毒濃縮回收率的測定方法，其中病毒為甲型肝炎病毒。