[發(fā)明專(zhuān)利]一種精氨酸脫亞胺酶及其重組表達(dá)方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910205114.9
• 申請(qǐng)日: 2009-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101792752A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李川江
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州華銀醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/80
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/80;C12N15/70;A61K38/50;A61K47/48;A61P35/00;A61P35/02;C12N11/08;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;楊曉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物活性蛋白質(zhì)及其交聯(lián)物的藥理學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種為優(yōu)化與聚乙二醇交聯(lián)而重組表達(dá)的精氨酸脫亞胺酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

精氨酸是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞分裂過(guò)程中起著重要的作用，但對(duì)人體而言卻是非必需氨基酸，正常細(xì)胞在氮的存在下能夠依靠精氨酰琥珀酸合成酶通過(guò)瓜氨酸合成精氨酸。然而，有些癌細(xì)胞因缺乏精氨酰琥珀酸合成酶的基因，而不能自身合成精氨酸，只能依靠外來(lái)的精氨酸細(xì)胞才能生存。也就是說(shuō)，精氨酸對(duì)有些癌細(xì)胞而言是必需氨基酸。因此，凡能分解耗盡外源性精氨酸的酶，例如精氨酸脫亞胺酶(arginine?deiminase)，就能使癌細(xì)胞因精氨酸的供給被阻斷而死亡。

有抗癌作用的精氨酸脫亞胺酶可從支原體等多種微生物中分離得到，它能在細(xì)胞內(nèi)將精氨酸分解成瓜氨酸和氨。在大腸桿菌中表達(dá)有抗癌活性的支原體精氨酸脫亞胺酶早有報(bào)告，并發(fā)現(xiàn)支原體精氨酸脫亞胺酶的活性比其它來(lái)源的精氨酸脫亞胺酶更強(qiáng)，目前研究得最透徹的支原體精氨酸脫亞胺酶來(lái)源于精氨酸型支原體，在培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)可有效地抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(參閱H.Takaku，In?vivo?antitumor?activity?of?arginine?deiminase?purified?frommycoplasma?arginini，Int.J.Cancer?51(1992)244-249)。

作為一種治療藥物，精氨酸脫亞胺酶本身就具有一般蛋白質(zhì)藥物的不足，即：穩(wěn)定性不好，在體內(nèi)很快被分解排出，其血清半衰期只有五小時(shí)。但精氨酸脫亞胺酶只有在血清中保持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的活性才能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起到治療作用。此外，精氨酸脫氨酶也是一種外源性蛋白質(zhì)，能誘發(fā)人體內(nèi)的免疫反應(yīng)，使酶失去活性或?qū)C(jī)體造成免疫損傷。聚乙二醇可與蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，精氨酸脫亞胺酶與聚乙二醇交聯(lián)后則有助于解決這些問(wèn)題。目前有多家公司生產(chǎn)可與蛋白質(zhì)交聯(lián)的活性聚乙二醇。已有中國(guó)專(zhuān)利報(bào)告，與聚乙二醇交聯(lián)可延長(zhǎng)精氨酸脫亞胺酶的血清半衰期(參閱中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?8805066.8公開(kāi)號(hào)：CN1255944，被修飾的精氨酸脫亞胺酶)。與聚乙二醇交聯(lián)的人型支原體精氨酸脫亞胺酶已進(jìn)入治療肝細(xì)胞癌和惡性黑色素瘤的臨床試驗(yàn)，并有少數(shù)病例的治療研究報(bào)告發(fā)表。(參閱F.Izzo，PEGylated?arginine?deiminase?treatment?of?patients?with?unresectablehepatocellulaar?carcinoma，J.Clin.Oncol.22(2004)，1815-1822)。

盡管應(yīng)用與聚乙二醇交聯(lián)的精氨酸脫亞胺酶治療某些癌癥的研究已有進(jìn)展，但是目前所用的精氨酸脫亞胺酶，包括人型精氨酸脫亞胺酶(Mycoplasma?hominus)，精氨酸型精氨酸脫亞胺酶(Mycoplasma?arginini)和關(guān)節(jié)炎型精氨酸脫亞胺酶(Mycoplasma?arthrititis)均來(lái)源于支原體等微生物。它與聚乙二醇交聯(lián)的賴(lài)氨酸位點(diǎn)是天然決定的，呈不合理分布，靠近催化中心的賴(lài)氨酸與聚乙二醇交聯(lián)后降低了酶的活性，因此只有重新安排與聚乙二醇交聯(lián)的賴(lài)基酸的位點(diǎn)，使其相對(duì)均勻地分布在精氨酸脫氨酶的表面，并避免聚乙二醇交聯(lián)在酶活性部位或其附近，這樣才能使聚乙二醇交聯(lián)的精氨酸脫亞胺酶的活性提高，發(fā)揮最佳的治療效果，同時(shí)隨著聚乙二醇交聯(lián)率的提高，酶的穩(wěn)定性也得到了提高，也進(jìn)一步減少了酶蛋白的異源性。目前尚未見(jiàn)到通過(guò)基因重組的方法全面優(yōu)化精氨酸脫亞胺酶上的賴(lài)氨酸位點(diǎn)來(lái)提高其與聚乙二醇交聯(lián)效果的報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種優(yōu)化的精氨酸脫亞胺酶(ruADI)。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述精氨酸脫亞胺酶的重組表達(dá)方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含了上述精氨酸脫亞胺酶的交聯(lián)物，該交聯(lián)物由精氨酸脫亞胺酶和活化聚乙二醇交聯(lián)而成。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述交聯(lián)物應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種精氨酸脫亞胺酶，其特征在于：所述精氨酸脫亞胺酶的編碼氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所述。

所述精氨酸脫亞胺酶的編碼核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所述。

上述精氨酸脫亞胺酶的重組表達(dá)方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)合成了精氨酸脫亞胺酶的13個(gè)DNA模板：

DNA模板1：