[發明專利]G-CSF融合蛋白突變體及其制備與應用

有效

• 申請號: 200910199337.9
• 申請日: 2009-11-25
• 公開（公告）號: CN101824091A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 溫曉芳;吳亦亮;王葉飛;楊志愉;范敏;王玉姣;方曉春;陸游
• 申請（專利權）人: 泰州貝今生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/19;C12N5/10;C12P21/02;A61K38/19;A61K47/48;A61P7/00;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及一種新的具有加速粒細胞恢復功能的融合蛋白，制備這種融合蛋白的方法， 含有這種融合蛋白的藥物制劑以及在醫藥領域，尤其是治療中性粒細胞減少癥或白細胞減 少癥方面的應用。

背景技術

人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，是一種來源于單核細胞和纖維組織母細胞的長鏈多肽 糖蛋白，可誘導造血干細胞的增值和分化，促進血液中的中性粒細胞數增加；另外還能刺 激成熟中性粒細胞從骨髓中釋放出并激活中性粒細胞的功能。G-CSF的空間主要結構為螺 旋，174個殘基中的103個形成了4個α螺旋(Hill?CP等，Proc?Natl?Acad?Sci?USA， 90：5167-5171，1993)，如圖1所示。自1991年起，重組人粒細胞集落刺激因子(rG-CSF) 已經廣泛用于治療癌癥化療導致的骨髓抑制，可以顯著改善化療所引起的中性粒細胞減少 癥的嚴重性和持續時間。目前，已經有多種商業化rG-CSF制劑在銷售，如非格司亭 (filgrastim)(商品名為和)，雷諾司亭(lenograstim)(商品名為 和)，那曲司亭(nartograstim)(商品名為)。其中， filgrastim和nartograstim都是重組大腸桿菌細胞產生的非糖基化的rG-CSF，而 lenograstim是CHO細胞表達的帶糖基化的rG-CSF。

但是，天然或重組的G-CSF由于分子量較小，極易被腎小球過濾，在人體內的循環半衰 期很短，只有2-4小時，每個化療周期需要每天注射1-2次，持續注射5-7天(Welte?K等， Proc?Nat?Acad?Sci?USA，82：1526-1530，1985；Frampton?JE等，Drugs，48：731-760， 1994)。延長G-CSF制劑體內半衰期可以減少給藥次數。增加G-CSF蛋白質的體內半衰期的 一個途徑是減少蛋白質的體內清除，包括通過腎臟的清除、蛋白酶降解和受體介導的清除。 可以通過將G-CSF蛋白與能增加表觀分子量的某些組分耦聯，從而降低腎臟的清除速率。 同時，將蛋白與這些組分連接可以有效地阻止蛋白酶與蛋白的接觸，從而降低被蛋白酶的 降解速率。血清中存在的一些長半衰期的蛋白，如白蛋白和IgG，存在一種FcRn介導的內 吞保護作用。其基本原理是：IgG的Fc部分和白蛋白在正常生理狀態下可以與細胞表面相 應的FcRn受體結合，結合后被內吞，在吞噬小泡中因為pH下降，其結合復合物解離，IgG 和白蛋白重新從細胞中被釋放，正是因為存在FcRn介導的循環作用保護了IgG和白蛋白不 被降解和代謝(Junghans?RP，Immunol?Res.，16：29-57，1997；Chaudhury?C等，J?Exp Med.，197：315-322，2003；Chaudhury?C等，Biochemistry.，45：4983-4990，2006)。 因此G-CSF與HSA或者IgG的Fc片段融合具有更長半衰期。通過聚乙二醇修飾重組人粒細 胞集落刺激因子(PEG-rG-CSF，商品名)(Harris?JM，Clin?Pharmacokinet， 40：539-551，2001)，可使G-CSF半衰期獲得了延長。通過白蛋白融合技術，即通過基因 工程方法將人白蛋白與G-CSF融合表達獲得的rHSA/G-CSF，也能提高G-CSF在體內的半衰期 (Wendy?Halpern等，Pharm?Res，19：1720-1729，2002)；同樣的，通過與抗體Fc片段融 合，也可以顯著改善G-CSF在體內的半衰期(Cox?George?N等：Experimental?Hematology， 32：441-449，2004)。

但是，現有的長半衰期G-CSF在臨床應用還是存在很多缺陷。

首先，雖然用PEG修飾或者白蛋白融合等技術可以提高G-CSF的分子量而改善其半衰期， 但是，由于G-CSF受體介導(receptor?mediated?clear，RMC)的清除路徑的存在，如下 文更加詳細的描述，這種改善也是有限的。