[發明專利]Ⅱ型副流感病毒熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910198902.X
• 申請日: 2009-11-17
• 公開（公告）號: CN102061340A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 沈維祥;何劍軍;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海復星醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥(集團)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括RNA提取液；RT-PCR反應液；混合酶；陽性標準模板；陽性對照和陰性對照。

2.如權利要求1所述的II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反應液含PCR?Buffer溶液；0.1～10μM濃度的引物P1、P2；0.1～10μM濃度的熒光探針FP；0.1～1mM的dNTPs溶液和1～10mM的MgCl₂。

3.如權利要求2所述的II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反應液中引物(P1、P2)和探針(FP)為II型副流感病毒HN基因片段，其中引物P1序列為：5’-CAATGGGACGCCTAAATATGGA-3’，引物P2序列為：5’-GAGGCAATCTCCAAGCATTACA-3’，熒光探針FP序列為：5’-AGACCCATTGGTGTTACACTCACAA-3’；

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；

或者與上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的堿基互補序列；

或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。

4.如權利要求3所述的風疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光探針標記的發光基團為FAM、HEX、JOE、TET、Cy3、Cy5、ROX、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine?Red、Rhodamine?6G、Orengon?Green?488、Orengon?Green?500、Orengon?Green?514、Texas?Red、TAMRA、Inosine、FITC或Acridine?orange中的任意一種；熒光淬滅基團為TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或DABSYL中的任意一種。

5.如權利要求1所述的II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的混合酶由1～10U的逆轉錄酶SuperscriptIII和1～10U的Taq?DNA聚合酶配制而成。

6.如權利要求1所述的II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性性標準模板為含有II型副流感病毒HN基因片段SEQ?ID?NO.1與PGEM-T?Easy載體構成的PGEMT151重組質粒SEQ?ID?NO.2。

7.如權利要求1所述的II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照為滅活的II型副流感病毒陽性樣本；陰性對照為無模板熒光定量反應液。

8.如權利要求1所述的II型副流感病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的RNA提取液為提取效率＞80％、RNA完整性好、穩定性好且操作簡便的核酸提取液。

9.一種II型副流感病毒檢測方法，其特征在于，采用II型副流感病毒檢測試劑盒，按以下步驟進行：

(a)采RNA提取液從待測標本中提取RNA；

(b)將標準陽性模板進行10倍梯度稀釋；

(c)分別取第(a)步中的RNA和第(b)步中的陽性標準模板，加入到含有混合酶的RT-PCR反應體系中，與標準陰性質控品一起用熒光定量PCR檢測儀進行RT-PCR檢測；

(d)通過比較待測樣本和標準品的循環域值而對待測樣品的起始拷貝數進行定量，在熒光定量PCR儀自帶軟件生成的標準曲線上找出待測樣品對應的拷貝數濃度。

10.如權利要求9所述的II型副流感病毒檢測方法，其特征在于，所述的待測樣本為痰液、咽拭子。