[發明專利]食品中大豆過敏原成分的實時熒光PCR定量檢測方法

有效

• 申請號: 200910198144.1
• 申請日: 2009-11-03
• 公開（公告）號: CN101851669A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 張舒亞;李妮;張佳誼;高琴
• 申請（專利權）人: 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及分子生物學和核酸檢測技術領域。具體的說，本發明涉及對食品中大豆過敏原成分的實時熒光PCR定量檢測方法和試劑盒。

背景技術

食品過敏現已成為一個新興的公眾性健康問題，調查顯示全世界范圍內有1％～2％的成年人對食品過敏，而低于三歲的兒童中有8％以上對食品過敏。過敏反應產生蕁麻疹、濕疹、哮喘、鼻炎、嘔吐、腹瀉和過敏性休克等癥狀。嚴重的食物過敏可導致死亡。對于食物過敏治療尚無特效方法，嚴格避免食用含有過敏成分的食品是最有效的療法。

近年來，一些國家和國際組織通過嚴密的科學調查和立法論證，相繼修改和出臺規范了食品中過敏原成分標識的法律法規，對食品標簽上過敏原成分的標識作出嚴格規定。美國、歐盟、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國家將常見大豆過敏原、花生、奶、蛋、魚、堅果、麩質和甲殼類動物等成分必須在食品標簽中標識。

大豆是一種常見的過敏原成分，美國、歐盟、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國要求在食品標簽中強制性標識。由于大豆具有較高的營養價值，其作為一種食品原料被廣泛用于各類食品的制作。更重要的是，大豆蛋白(大豆濃縮蛋白、大豆分離蛋白等)、大豆卵磷脂等大豆制品是一種重要的食品添加劑(作為乳化劑、穩定劑、發泡劑、凝固劑等)被廣泛應用于食品工業，如嬰兒配方食品、肉類產品、面包點心、乳制品和各種可食用產品。

大豆作為配料中一個組成成分，可能在標簽標識中不能體現，它是一種潛在的過敏原，其危害性更大。所以，建立食品中大豆過敏原成分的特異、靈敏和可定量的檢測方法，對保護消費者健康和知情權，對食品標簽過敏原標識提供技術保障，為保障出口企業的國際貿易順利進行等方面具有十分重要的意義，是迫在眉睫要解決的食品安全問題和檢驗檢疫問題。

然而，在食品中大豆過敏原成分檢測存在諸多難點，這主要是因為食品的成分復雜，干擾因素多，對檢測方法帶來了巨大挑戰。目前對大豆成分的檢測，主要是采用轉基因大豆檢測的內源基因(Lectin基因)。針對過敏原基因的檢測，主要是對P34蛋白的普通PCR檢測和SYBR?green的實時熒光PCR檢測，但檢測靈敏度僅0.01％。檢測靈敏度難以滿足檢測需要，此外，尚沒有對主要過敏原基因的TaqMan探針的實時熒光PCR檢測方法和定量檢測方法。

綜上所述，鑒于目前尚沒有特異性好、靈敏度高的食品中大豆過敏原成分的實時熒光檢測方法。因此，本領域迫切需要開發高特異性、高靈敏度的食品中大豆過敏原成分的實時熒光PCR定性定量檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高、準確、簡便的食品中大豆過敏原成分的實時熒光RT-PCR檢測方法。

本發明的另一目的在于提供食品中大豆過敏原成分的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。

本發明的再一目的在于提供食品中大豆過敏原成分檢測相關引物和探針。

在本發明的第一方面，提供了一種聚合酶鏈式反應方法，它包括步驟：在聚合酶反應體系中進行聚合酶鏈式反應，所述的反應體系中含有擴增大豆過敏原成分的特異性引物對和大豆過敏原成分特異性探針，并且所述引物擴增出的擴增產物具有大豆P34蛋白編碼基因的中部區域的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的大豆P34蛋白編碼基因的中部區域指SEQ?ID?NO：5的第1600-2500位的核苷酸序列，較佳地指SEQ?ID?NO：5的第1700-2100位的核苷酸序列，更佳地指SEQ?ID?NO：5的第1790-1942位的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的擴增大豆過敏原成分的特異性引物對包括：SEQ?IDNO：1和SEQ?ID?NO：2所示的引物。

在另一優選例中，所述的大豆過敏原成分特異性探針是Taqman探針。

在另一優選例中，所述的大豆過敏原成分特異性探針具有選自下組的核苷酸序列：SEQ?ID?NO：3。

在另一優選例中，所述方法還包括步驟：在聚合酶鏈式反應過程中或之后，檢測大豆過敏原成分特異性探針發出的熒光信號。

在另一優選例中，所述的反應體系中含有來自食品的待檢測的核酸樣品。

在本發明的第二方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有以下試劑：

(a)擴增大豆過敏原成分的特異性引物對，并且所述引物擴增出的擴增產物具有大豆P34蛋白編碼基因的中部區域；

(b)大豆過敏原成分特異性探針。

在另一優選例中，所述的擴增大豆過敏原成分的特異性引物對包括：SEQ?IDNO：1和SEQ?ID?NO：2所示的引物。

在另一優選例中，所述的大豆過敏原成分特異性探針是Taqman探針。