[發(fā)明專利]一種適冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其制備方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910198068.4
• 申請日: 2009-10-30
• 公開（公告）號: CN102051350A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂紅;周峻崗;袁漢英
• 申請（專利權(quán)）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/15;C12N5/10;A23K1/165;C12P7/10;C12P19/14;C12R1/19;C12R1/865;C12R1/84;C12
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域，涉及一種適冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能纖維素降解酶及其制備方法和應用。本發(fā)明還涉及該木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶的重組表達質(zhì)粒和重組基因工程菌株。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素是自然界中豐富的可再生能源，由四種主要成份：纖維素(～33-51％)，半纖維素(～19-34％)，果膠(～2-20％)以及木質(zhì)素(～20-30％)。木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生可發(fā)酵的己糖(hexose)(葡萄糖，36～50％；甘露糖，0.3～12％；半乳糖，0.1～2.4％)和戊糖(pentose)(木糖，3.4～23％；阿拉伯糖，1.1～4.5％)。半纖維素的骨架結(jié)構(gòu)是由β-1，4木聚糖，而木聚糖的降解酶主要由內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)和β-1，4-木糖苷酶(β-1，4-xylosidase，EC3.2.1.37)完成，。人們對木聚糖酶進行了系統(tǒng)的研究，但β-木糖苷酶卻未得到足夠重視。β-木糖苷酶是一種外切酶，以外切方式從非還原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解產(chǎn)物為木糖。β-木糖苷酶在自然界中分布非常廣泛，現(xiàn)已從細菌、放線菌和真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分離得到。β-木糖苷酶是木聚糖降解的關(guān)鍵酶之一，有著重要的工業(yè)應用價值。在能源工業(yè)中，工農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶系轉(zhuǎn)化為木糖，而木糖又可被細菌及真菌轉(zhuǎn)化成酒精等有價值的燃料；在醫(yī)藥行業(yè)中，木聚糖酶系水解特定底物可產(chǎn)生在醫(yī)藥行業(yè)具有重要應用價值的中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。例如，1998年P(guān)atel等人利用Moraxella.sp?β-木糖苷酶水解10-去乙酰巴卡亭III木糖苷和10-去乙酰紫杉醇木糖苷7位木糖殘基，得到重要的中間產(chǎn)物10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇，為紫杉醇的合成開辟了一條嶄新的途徑(Annu?Rev?Microbiol?52：95-361，1998)。

L-阿拉伯糖屬于五碳醛糖，以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖體及類似于高等植物半纖維的形式存在。L-阿拉伯糖是一種沒有熱量的甜料，能抑制水解雙糖的酶，抑制因攝入蔗糖而導致的血糖升高，因此可以抑制肥胖、預防并治療與高血糖相關(guān)的疾病，已被美國食品藥品監(jiān)督局和日本厚生省批準列入健康食品添加劑。L-阿拉伯糖還可以用作醫(yī)藥中間體、用于生化領(lǐng)域中細菌培養(yǎng)基的制備以及香料合成等(化學與生物工程23：50-52，2006)。此外，L-阿拉伯糖可用于合成核苷類似物等抗病毒藥物，治療白血病、癌癥的化療藥物等，據(jù)了解目前全球共有5種進入三期臨床試驗的抗乙肝新藥，其中兩種采用L-阿拉伯糖為原料(Antivir?Ther.3：113-121，1998；Tetrahedron?65：1937-1949，2009)。L-阿拉伯糖的工業(yè)提取方法一般是采用堿提取植物中的半纖維素，然后酸水解工藝成本高，環(huán)境污染嚴重。因此，高效、節(jié)能、環(huán)保的生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)L-阿拉伯糖成對我國的生物能源產(chǎn)業(yè)和功能糖產(chǎn)業(yè)都有非常重大的意義。隨著國外對β-木糖苷酶的研究已日趨深入，發(fā)現(xiàn)一些β-木糖苷酶活還具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性，即雙重活性。而國內(nèi)相關(guān)研究仍然報道甚少，僅薛業(yè)敏等從嗜熱厭氧菌Thermoanaerobacter?ethanolicus中克隆到具有這一性質(zhì)的酶Xar(食品與發(fā)酵工業(yè)29：22-26，2003)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型的具有木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能的糖苷水解酶。

本發(fā)明的另一目的是提供該木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供該木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的應用。

本發(fā)明提供了一種木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶，其氨基酸序列如SEQID?NO.2所示。它的核苷酸編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明還提供了含有所述的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙功能酶的核苷酸編碼序列的重組載體，該重組載體包括擴增載體和表達載體等。表達載體可以是例如大腸桿菌表達載體、釀酒酵母表達載體、畢赤酵母表達載體、枯草芽孢桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、絲狀真菌表達載體、昆蟲表達載體或者哺乳動物細胞表達載體等常規(guī)表達載體。本發(fā)明還提供了含有上述的重組載體的重組菌株，該菌株的宿主細胞可以是大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、絲狀真菌、昆蟲或者哺乳動物細胞中等。