[發明專利]葡萄糖苷酶/木糖苷酶雙功能纖維素降解酶RuBGX2及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 200910197703.7
• 申請日: 2009-10-26
• 公開（公告）號: CN102041251A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 呂紅;包蕾;周峻崗;袁漢英;詹志春
• 申請（專利權）人: 復旦大學;武漢新華揚生物股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12P19/14;C12R1/645;C12R1/01;C12R1/685;C12R1/125;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/19
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術領域

本發明屬生物工程領域，涉及一種葡萄糖苷酶/木糖苷酶雙功能纖維素降解酶及其制備方法和應用。本發明還提供了該葡萄糖苷酶/木糖苷酶的重組質粒和重組基因工程菌株。

背景技術

木質纖維素是地球上分布最廣，含量最豐富的可再生性碳水化合物，主要由纖維素，半纖維素和木質素組成。其中纖維素的水解，需要內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(又稱為纖維二糖水解酶)和β-葡萄糖苷酶這三種纖維素酶的共同作用；而半纖維素的水解則需要內切β-1，4-木聚糖酶和β-1，4-木糖苷酶這兩種酶的共同作用。

葡萄糖苷酶和木糖苷酶在纖維素和半纖維素主鏈的降解中主要是水解纖維寡糖(主要是纖維二糖)和木寡糖，解除纖維寡糖和木寡糖對內切纖維素酶和木聚糖酶的產物抑制效應，使內切纖維素酶和木聚糖酶能夠充分的發揮作用；同時，如果要將纖維素和半纖維素充分水解為葡萄糖和木糖，葡萄糖苷酶和木糖苷酶是不可或缺的。

β葡萄糖苷酶能水解二糖，纖維寡糖和烷基、芳基葡萄糖苷中的β葡萄糖苷鍵，根據氨基酸序列的相似性，它們屬于糖苷水解酶家族1和3。木糖苷酶能水解木寡糖，烷基、芳基木寡糖中的β木糖苷鍵，根據氨基酸序列的相似性，它們屬于糖苷水解酶家族3，39，43，52，54。

目前已發現和克隆了為數眾多的纖維素酶，據不完全統計，國內外共記錄了產纖維素酶的菌株大約已有53個屬的幾千個菌株，其中絕大部分是通過傳統的分離培養方法獲得的，按來源主要分為細菌類纖維素酶和真菌類纖維素酶，按生長條件可分為需氧菌和厭氧菌。其中，細菌來源的纖維素酶一般最適pH為中性至偏堿性，且對天然纖維素的水解能力較弱，主要應用于紡織中的水洗整理及洗滌工業中，而難以用于生物燃料的生產；真菌來源的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，主要用于飼料業，但是由于真菌來源的纖維素酶要形成酶系才能發揮較好的作用，而酶系的成分往往很復雜，而單個成分的酶酶活又較低，因此限制了它在生物能源方面的應用。而且這些纖維素酶主要對于可溶性，純的纖維素水解能力較高，對于不溶性纖維素的活性很低甚至沒有，而對于混有抗營養因子的不溶性纖維素更是無能為力，以目前得到的酶的活力，還無法用于工業化分解纖維素生產生物能源，因此，克隆新型高活性的纖維素酶具有巨大的科研意義和工業意義。

關于β-葡萄糖苷酶基因已有一些專利和文獻報道。如：Dion等報道了Thermus?thermophilus的β-葡萄糖苷酶基因(glycoconjugate?J，16：27-37，1999)；Gonzalez等報道了芽孢菌Bacillus?polymyxa的β-葡萄糖苷酶基因(Biochem?Biophys?Res?Commun，194：1359-1364，1993)；Wrightdd等報道了Microbispora?bispoera的β-葡萄糖苷酶基因(Appl?EnvironMicrobiol，63；3902-3910，1997)；Lieb等報道了Thermotoga?mariti的β-葡萄糖苷酶基因(Mol?Gen?Genet，242：111-115，1994)；Tonouchi等報道了Acetobacter?xylinum的β-葡萄糖苷酶基因(美國專利USP6316251，2001年11月31日)。目前國內關于木糖苷酶的專利也很少，僅有南開大學(中國專利號：200710063139.0)和丹麥的丹尼斯科公司(中國專利號：CN96194959.7)兩項。而與木糖苷酶的研究報道也僅有曲霉(Aspergillus)β-木糖苷酶的分離純化及基因克隆。

具有β-葡萄糖苷酶和木糖苷酶雙功能活性的酶比較少見，算上早期以生化方式研究的，總共也不到十個蛋白，而將雙功能基因克隆出來的，目前國內外僅有三篇文獻報道，即Brunner等(Phytochemistry，59(2002)689-696)從馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora?infestans)中克隆到的β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶，和VROEMEN，S等(MOLECULAR&GENERAL?GENETICS，246(1995)，465-477)從Erwinia?chrysanthemi中克隆到的萄糖苷酶/木糖苷酶，Derek?K等(Biochimica?et?Biophysica?Acta，(1998)78-88)從Agrobacterium?tumefaciens中克隆到的Cbg1s。而且從這些酶的性質來看，雖然具有雙功能活性，但是木糖苷酶的活性只占葡萄糖苷酶的活性的不到20％，甚至不到10％，因此是以葡萄糖苷酶活性為主導的。

發明內容