[發明專利]四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法

無效

• 申請號: 200910196910.0
• 申請日: 2009-10-09
• 公開（公告）號: CN102040674A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 馬涌;宛薇
• 申請（專利權）人: 馬涌;宛薇
• 主分類號: C08B37/12
• 分類號: C08B37/12;C07C229/16;C07C227/08;C07K1/22
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1.乙二胺二乙酸快速制備方法，包括以下步驟：

1)在控制溫度下，往乙二胺10-80％水溶液中定量慢慢加入溴乙酸(BrCH₂COOH)，乙二胺與溴乙酸摩爾濃度準確控制在1∶2，溴乙酸摩爾濃度準確控制非常重要，應當準確的控制在1摩爾乙二胺與2摩爾溴乙酸的比例。

2)慢慢加入30％碳酸鈉或其他堿溶液調節pH值至大約9以上，攪拌，控溫，使乙二胺與入溴乙酸反應完全生成乙二胺二乙酸，乙二胺與溴乙酸化學反應式為：

NH₂-CH₂-CH₂-NH₂+2BrCH₂COOH→NH(CH₂COOH)-CH₂-CH₂-N(CH₂COOH)+2Br

3)副產物溴可以用物理或化學方法除去。例如，加硝酸銀沉淀，過濾。

2.乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法，包括以下步驟：

1)首先將瓊脂糖凝膠環氧活化，向瓊脂糖凝膠加入2M的氫氧化鈉和環氧氯丙烷，混合，在30-70℃溫度下恒溫2-9小時，生成環氧活化的瓊脂糖凝膠。

2)乙二胺二乙酸與瓊脂糖凝膠偶聯的具體方法是，先將環氧活化的瓊脂糖凝膠吸干，然后加2M碳酸鈉溶液，再加適量的乙二胺二乙酸，在50-70℃溫度下恒溫5-15小時生成乙二胺二乙酸瓊脂糖凝。

3)加載過渡金屬離子，將乙二胺二乙酸瓊脂糖凝用稀醋酸和去離子水洗滌，然后用稀硫酸鎳，或稀硫酸銅或其它過渡金屬鹽溶液浸泡，然后用pH＝7.5的緩沖溶液沖洗，可以得到不同的加載過渡金屬離子的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。

3.本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝是四配體金屬螯材料，用于純化組胺酸標記(His?Tag)的蛋白質和含組胺酸，賴氨酸豐富的蛋白質。

1)乙二胺二乙酸與EDTA(乙二胺四乙酸)的結構相似但相差二個乙酸結構.乙二胺二乙酸比金屬螯合力極強的EDTA的金屬鰲合力弱，乙二胺二乙酸是四配體金屬螯合材料具有一定的金屬螯合性同時螯合上的金屬也可以在特定的條件下被洗脫.乙二胺二乙酸可以提供二個酸基和由兩個氮原子提供兩個配位孤電子對進行金屬螯合，本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠可以形成穩定固相金屬鰲合基質從而能夠與蛋白質中的組胺酸，賴氨酸半胱氨酸等形成強烈的鰲合作用。

2)在純化蛋白中的應用，目前廣泛應用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)和亞胺基二乙酸瓊脂糖凝膠(IDA瓊脂糖凝膠)廣泛用于蛋白質提純[1，2，3]，本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠與次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)在用于蛋白純化時基本作用原理一致，但配位體不同，IDA瓊脂糖凝膠提供一個氮原子和乙二酸根作為三配位體金屬鰲合基質，NTA瓊脂糖凝膠提供一個氮原子核三酸根作為四配位體金屬鰲合基質，本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠提供二個氮原子和二酸根作為四配位體金屬鰲合基質，故在蛋白質提純過程中可以展現出新的特異性，從而給蛋白質純化工作提供了新的金屬螯合層析填料選擇。