[發明專利]四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法

無效

• 申請號: 200910196910.0
• 申請日: 2009-10-09
• 公開（公告）號: CN102040674A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 馬涌;宛薇
• 申請（專利權）人: 馬涌;宛薇
• 主分類號: C08B37/12
• 分類號: C08B37/12;C07C229/16;C07C227/08;C07K1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及蛋白純化領域，特別地，本發明涉及金屬螯合層析填料制備方法。

背景技術

金屬螯合層析，也稱固定化金屬親和層析是利用金屬離子與蛋白質相互作用，特別是過渡金屬離子如鎳，銅，鐵，鋅等的離子和蛋白質中特定氨基酸如色氨酸組氨酸半胱氨酸之間的螯合配位作用使蛋白質被金屬螯合層析介質吸附從而達到選擇分離純化蛋白質的目的，目前此技術已經廣泛應用于帶6組氨酸標記的蛋白質(6xHis-tag?Protein)純化，以及其它含有豐富色氨酸組氨酸半胱氨酸的蛋白質純化。其中NTA瓊脂糖應用最為廣泛。

金屬螯合層析填料分兩大部分，1。填料基質：主要有瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠等作為載體，2。填料金屬螯合分子：目前在蛋白純化中廣泛應用的亞氨基二乙酸(IDA瓊脂糖)，次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖)，通過化學方法使金屬螯合分子與填料基質結合形成金屬螯合層析填料。亞氨基二乙酸(IDA)的螯合配位特點是兩個酸基和一個氮原子(提供一個電子對供螯合)與配位金屬離子螯合形成三個配位體。次甲基三乙酸(NTA)的螯合配位特點是三個酸基和一個氮原子形成四個配位體(三個酸帶有三個負電荷)與配位金屬離子螯合。

本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖是全新螯合配位物體，特點是乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠中的乙二胺二乙酸可以提供二個酸基和二個氮原子形成四個配位體(二個酸帶有二個負電荷)與配位過渡金屬離子Ni，Cu，Mn，Co，Zn等作用時可以形成一個四配位鰲合中心。本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖與現在廣泛應用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖)同為四配位金屬鰲合物，但由于配位原子不同和所帶負電荷量不同故與蛋白質結合能力特點也有不同，本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖為蛋白質純化提供了新的選擇。

發明內容

本發明乙二胺二乙酸瓊脂糖是新型金屬螯合層析填料，為蛋白質純化提供了新的層析填料選擇，乙二胺二乙酸瓊脂糖凝(EDDA瓊脂糖凝膠)制備包括下列步驟：

乙二胺二乙酸制備：

1)在5-20℃控制溫度下，制備乙二胺10-80％水溶液，然后往10-80％乙二胺水溶液定量慢慢加入溴乙酸(BrCH₂COOH)，攪拌均勻制備成乙二胺與溴乙酸水溶液，乙二胺與溴乙酸摩爾濃度準確控制在1∶2，溴乙酸摩爾濃度準確控制非常重要。乙二胺與溴乙酸的化學反應式為：

NH₂-CH₂-CH₂-NH₂+2BrCH₂COOH→

NH(CH₂COOH)-CH₂-CH₂-N(CH₂COOH)+2Br

2)慢慢調節乙二胺與溴乙酸混合水溶液PH值至9-11，攪拌，控溫，使乙二胺與入溴乙酸反應生成乙二胺二乙酸，乙二胺與溴乙酸混合水溶液在堿性條件下反應激烈，整個反應應當在通風櫥中進行。反應完全后用旋轉蒸發儀濃縮結晶。

3)反應檢測和除去雜質，薄膜層析(TLC)和茚三酮(茚三酮Ninhydrin是靈敏的氨基顯色試劑)可以作為檢測方法，反應副產物溴可以化學方法除去，例如加硝酸銀，沉淀，過濾。

乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法，包括以下步驟：

1)制備環氧活化瓊脂糖凝膠，將購自Novelab.com公司的瓊脂糖CL-4B凝膠放在沙芯漏斗吸干后放入燒杯內，加入2M氫氧化鈉，加入環氧氯丙烷，混合后在恒溫攪拌器上攪拌加熱保持溫度在45-70℃兩個小時，然后添加環氧氯丙烷保持溫度在45-70℃三個小時，然后將反應物放入沙芯漏斗吸干。此吸干反應物是環氧活化瓊脂糖凝膠。

2)將乙二胺二乙酸接臂到瓊脂糖CL-4B凝膠上，將2-3M碳酸鈉溶液加入吸干反應物是環氧活化瓊脂糖凝膠中，然后加入乙二胺二乙酸溶液，混合后在恒溫攪拌器上攪拌加熱保持溫度在45-70℃十五個小時，然后將混合物放在沙芯漏斗吸干，此吸干混合物即為乙二胺二乙酸瓊脂糖凝，可放在30％乙醇溶液4度下保存。

3)加載過渡金屬離子，用pH＝7.3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙醇溶液，然后用300mM金屬離子浸泡，再升用pH＝7.3緩沖溶液洗滌。

乙二胺二乙酸瓊脂糖凝的使用范圍主要是用于蛋白質提純。

1)乙二胺二乙酸與EDTA(乙二胺四乙酸)結構相似差二個乙酸結構，故金屬螯合力強但比EDTA弱，乙二胺二乙酸能提供二個酸基和二個配位氮原子對進行金屬螯合，乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠作為固相強力金屬螯合合劑。