[發明專利]一種基于雙核微核的DNA修復能力檢測方法

有效

• 申請號: 200910196677.6
• 申請日: 2009-09-28
• 公開（公告）號: CN102031285A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發明（設計）人: 夏昭林;焦潔;孫品;馮楠楠;孫原;譚紅訕
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

1.一種基于雙核微核的DNA修復能力檢測方法，其特征在于，以雙核微核為觀察終點，以博萊霉素誘導淋巴細胞DNA染色體損傷，用胞質分裂阻滯微核試驗與DNA修復酶抑制劑3-氨基苯甲酰胺結合，測定修復后剩余的DNA損傷，通過下式分別計算微核率和3AB指數，檢測、評價DNA損傷后修復能力；

微核率＝微核數/觀察細胞數×1000‰；

3AB指數＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。

2.按權利要求1所述的DNA修復能力檢測方法，，其特征在于，包括下述步驟：

1)胞質分裂阻滯微核試驗

建立胞質分裂阻滯微核試驗技術；

2)博萊霉素試驗濃度和3-AB試驗濃度的確定

選取受試對象外周血淋巴細胞，采用不同濃度博萊霉素和不同濃度的3-AB來進行該試驗，每次試驗均進行平行試驗，根據細胞活力和每1000個淋巴細胞中的微核數確定博萊霉素濃度和3-AB濃度；

3)淋巴細胞培養；

4)淋巴細胞收獲與制片；

5)鏡檢閱片與DNA修復能力的檢測。

3.按權利要求2所述方法，其特征在于，其中步驟2)的博萊霉素濃度和3-AB濃度，分別為1ug/ml和1.25mmol/L。

4.按權利要求2所述的方法，其特征在于，通過下述步驟培養所述的淋巴細胞：

在15ml的刻度離心管中加入組合培養液，每管4.5ml，PHA?0.2ml/管，最后加0.5ml抗凝血，每份樣品均做平行培養，37℃培養24h，加入BLM(BLM應用液加入50ul為3ug/ml，加入16.67ul為1ug/ml)，37℃培養30min，之后用5ml的培養基(含10％胎牛血清)1000g離心10min洗兩次，之后一份繼續培養，另一份加入3-AB(本次采用1.25mmol/L即在5ml體系中加入31.25ul)繼續培養。20h后加細胞松弛素B應用液100μl，終濃度6μg/ml，繼續培養28h收獲。

5.按權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的BLM應用液加入50ul為3ug/ml，加入16.67ul為1ug/ml；所述的的5ml的培養基中含10％胎牛血清。

6.按權利要求2所述方法，其特征在于，其中淋巴細胞收獲與制片通過下述步驟：

a.培養結束后離心1000g/min?10min，棄上清液；

b.低滲：將3ml?0.075M?KCl?37℃加入離心管，混勻1-5min；

c.加固定液4ml，混勻，預固定；

d.離心10min，棄上清液；e.加固定液5ml，混勻，室溫固定30min，離心，棄固定液；f.重復步驟e，加0.3-0.5ml固定液混勻；

h.滴片：將玻片從冰水中取出，滴片，自然干燥，過夜后再染色；

i.10％Giemsa染色10min，鏡檢分析。

7.按權利要求6所述方法，其特征在于，所屬的步驟c)的固定液中，甲醇∶冰醋酸為3∶1。

8.按權利要求2所述方法，其特征在于，通過下述步驟檢測所述的DNA修復能力：

低倍鏡下尋找細胞分散均勻的視野，轉油鏡或計算機圖像轉換分析系統下觀察；選擇胞漿完整的雙核淋巴細胞，微核位于細胞質中，與細胞核相切或完全分開，邊緣光滑，嗜色性與細胞核完全一致，大小為主核的1/3以下，不與主核接觸；計數1000個雙核淋巴細胞中含一個、兩個或多于兩個微核的細胞數，計算雙核微核細胞率；以微核率和3AB指數作為分析指標；所述微核率＝微核數/觀察細胞數×1000‰；所述3AB指數＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。