[發(fā)明專利]EGFP融合的β2腎上腺素能受體、其重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910196519.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101671688A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴小峰;毛春鴻;陳宇光;彭可順;蘇潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C07K19/00;C12N15/81;C12P21/02;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海上大專利事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 陸聰明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP融和的人類β2腎上腺 素能受體β2AR(簡(jiǎn)稱EGFP-β2AR)、其重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。

技術(shù)背景

β2-腎上腺素能激動(dòng)劑(簡(jiǎn)稱β2激動(dòng)劑)是一類激素類藥物，其成員為數(shù)眾多，包括克倫 特羅(俗稱瘦肉精)、沙丁胺醇、萊克多巴胺等數(shù)十種，其作用機(jī)制是：β2-激動(dòng)劑結(jié)合于β 2-腎上腺素能受體(簡(jiǎn)稱β2AR)，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生理效應(yīng)，臨床 上用于治療哮喘和支氣管痙攣等相關(guān)疾病。遵循同樣的作用機(jī)制，β2-激動(dòng)劑還具有增強(qiáng)肌 肉，減少脂肪的副效應(yīng)，已被濫用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑以提高家畜瘦肉率。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明β 2-激動(dòng)劑一旦飼用便難以代謝排出，易大量蓄積在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)。人類在食用帶有殘留藥物的 肉類食品后，會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、頭暈等中毒癥狀，因此迫切需要加大β2激動(dòng)劑檢測(cè)力 度。

當(dāng)前檢測(cè)β2激動(dòng)劑殘留的方法主要有兩類：即化學(xué)檢測(cè)法、免疫檢測(cè)法(IA)。化學(xué)檢 測(cè)法其最低檢測(cè)限范圍為1～15ng/g，具有較高的靈敏度，但它存在樣品處理繁雜，檢測(cè)時(shí)間 長(zhǎng)，儀器貴重，難于操作，通量低等缺點(diǎn)，因此常作確證性方法。免疫檢測(cè)法(主要為酶聯(lián) 免疫分析)具有較高的檢測(cè)通量，且快速方便、成本低，常用于多樣品篩查。免疫檢測(cè)法的 缺點(diǎn)是一種β2激動(dòng)劑的抗體只能檢測(cè)一種或少數(shù)幾種β2激動(dòng)劑，因此隨著現(xiàn)今被濫用的β2 激動(dòng)劑種類的增多，該法常出現(xiàn)假陰性。基于受體-配基系統(tǒng)的檢測(cè)方法則克服了這一缺點(diǎn)， 具有以下其他方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：

高特異性-受體與配基的結(jié)合具有嚴(yán)格的立體構(gòu)象互補(bǔ)性。

高親和力-受體-配基系統(tǒng)親和力高于抗原-抗體系統(tǒng)。

廣譜性-基于受體-配基系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)可一次檢出所有種類的β2-激動(dòng)劑，將其“一網(wǎng) 打盡”。

因此構(gòu)建一種能夠識(shí)別并結(jié)合β2-激動(dòng)劑，同時(shí)能夠提供檢測(cè)信號(hào)的雙功能原件，即重組 融合受體成為目前研究的主流。

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的之一在于提供一種EGFP融和的人類β2腎上腺素能受體β2AR(簡(jiǎn)稱EGFP -β2AR)，該重組融合受體是能夠識(shí)別并結(jié)合β2-激動(dòng)劑，同時(shí)能夠提供檢測(cè)信號(hào)的雙功能 原件。

本發(fā)明的目的之二在于提供該重組融合受體的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供該重組融合受體的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明的目的之四在于提供該重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種EGFP融和的β2腎上腺素能受體，其特征在于該融合受體具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ?ID?NO?1所示的堿基序列；

2)與序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同生物學(xué) 功能蛋白質(zhì)的DNA序列。

一種上述的融合受體的編碼蛋白，該蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ?ID?NO?2所示的氨基酸序列；

2)通過(guò)將SEQID?NO?2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該衍生蛋白質(zhì)與SEQ?ID?NO?2的蛋白具有相同的生物 學(xué)功能。

一種構(gòu)建上述的融合受體的方法，該方法包括如下步驟：

1)在已構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZα-β2AR外源片段3’下游的Not?I和Xba?I位點(diǎn)處插入 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因序列，得到新的重組表達(dá)載體pPICZα-EGFP-β2AR。

2)重組表達(dá)載體經(jīng)酶切驗(yàn)證后，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，用Zeocin抗性篩選克隆并 對(duì)其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得重組酵母工程菌pPICZα-EGFP-β2AR-GS115。

3)甲醇誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，獲得融合重組受體EGFP-β2AR，經(jīng)熒光和Dot-blot鑒定該重 組融合受體定位于細(xì)胞膜上，經(jīng)放射配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明重組融合受體保留配基結(jié)合活性。

一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。

一種上述的重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體為pPICZα-EGFP-β2AR，其基因 具有具有SEQ?ID?NO?3所示的堿基序列。