[發(fā)明專利]EGFP融合的β2腎上腺素能受體、其重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910196519.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN101671688A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴小峰;毛春鴻;陳宇光;彭可順;蘇潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C07K19/00;C12N15/81;C12P21/02;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海上大專利事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 陸聰明

1.一種EGFP融和的β2腎上腺素能受體，其特征在于該融合受體具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ?ID?NO?1所示的堿基序列；

2)與序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同生物學(xué) 功能蛋白質(zhì)的DNA序列。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合受體的編碼蛋白，該蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ?ID?NO?2所示的氨基酸序列；

2)通過將SEQ?ID?NO?2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該衍生蛋白質(zhì)與SEQ?ID?NO?2的蛋白具有相同的生物 學(xué)功能。

3.一種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合受體的方法，該方法包括如下步驟：

1)在已構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZ?α-β2AR外源片段3’下游的Not?I和Xba?I位點(diǎn) 處插入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因序列，得到新的重組表達(dá)載體pPICZα-EGFP-β2AR。

2)重組表達(dá)載體經(jīng)酶切驗(yàn)證后，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115，用Zeocin抗性篩選克 隆并對(duì)其基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得重組酵母工程菌pPICZα-EGFP-β2AR-GS115。

3)甲醇誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，獲得融合重組受體EGFP-β2AR，經(jīng)熒光和Dot-blot鑒 定該重組融合受體定位于細(xì)胞膜上，經(jīng)放射配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明重組融合受體保留配基結(jié)合活 性。

4.一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體為pPICZα-EGFP- β2AR，其基因具有具有SEQ?ID?NO?3所示的堿基序列。

6.一種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

從載體pEGFP-N1中PCR分離EGFP基因，所用的引物為：

上游引物：ATAGCGGCCGCA?ATGGTGAGCAAGGGC；

?????????????????Not?I

下游引物：CGGCTCTAGACTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC；

?????????????????Xba?I

瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物經(jīng)Not?I和Xba?I線性化后和用相同內(nèi)切酶線性化的重組載體 pPICZα-β2AR進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，并涂布25ug/mgZeocin抗性LB 平板；挑取10個(gè)陽性克隆，用試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)NotI和XbaI雙酶切后電泳得到約4.8kb 及750Pb的兩個(gè)片段；經(jīng)EcoR?I和Xba?I雙酶切鑒定獲得約3.5kb及2kb的兩個(gè)片段；經(jīng)Not I單酶切，獲得的一個(gè)約5.5kb的片段，即為重組表達(dá)載體pPICZα-EGFP-β2AR。

7.一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組載體。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母。