[發(fā)明專利]異養(yǎng)小球藻中污染細(xì)菌動態(tài)的分子檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910196272.2
• 申請日: 2009-09-24
• 公開（公告）號: CN101665836A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 錢文倩;李志勇;張風(fēng)麗;繆曉玲
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/19;C12R1/07;C12R1/125
• 代理公司: 上海交達專利事務(wù)所
• 代理人: 毛翠瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)小球藻中污染細(xì)菌動態(tài)的分子檢測方法，屬于微生物分子技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

小球藻屬綠藻門，綠藻綱，綠藻目，卵胞藻科，小球藻屬。小球藻被稱之為“藥效藻”、生理功能物質(zhì)的“生物反應(yīng)器”，是堿性全營養(yǎng)素食品。由于小球藻對人體具有很好的保健作用，這種堪稱地球“生命源泉”的綠藻幾乎含有所有屬于人體健康營養(yǎng)的物質(zhì)：豐富的小分子多肽蛋白質(zhì)由17種氨基酸組成、不飽和脂肪酸、生物活性多糖及保持細(xì)胞正常生長因子、核酸、各種維生素、多種微量元素、生物素、大量的葉酸與葉綠素等活性代謝物質(zhì)。小球藻能將人體內(nèi)有害的重金屬、化學(xué)有害物質(zhì)(農(nóng)藥、化肥、抗生素等)有效清除，從而使免疫系統(tǒng)的敏感性增強、致病因素排除；營養(yǎng)素的補充又為免疫功能的發(fā)揮提供充足的能量。

小球藻除了可以利用光能和CO₂進行正常的光合自養(yǎng)生長外，還可以在無光條件下利用有機碳源和O₂，進行異養(yǎng)生長繁殖。小球藻也能在光照條件下，利用有機碳源進行混養(yǎng)培養(yǎng)。由于小球藻異養(yǎng)可以獲得比自養(yǎng)高的生物量，因此異養(yǎng)培養(yǎng)在小球藻高密度培養(yǎng)方面有著重要應(yīng)用價值。

異養(yǎng)小球藻細(xì)胞可利用有機碳源快速異養(yǎng)生長，而且異養(yǎng)小球藻細(xì)胞中還含有大量的脂肪，這對于有機廢物合理利用，治理環(huán)境污染都具有十分重要的意義。另外自養(yǎng)小球藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異養(yǎng)生長后，細(xì)胞內(nèi)脂溶性化合物增多，高溫下產(chǎn)油產(chǎn)氣效率更高，這對于探索石油和天燃?xì)獾某梢蚓哂兄匾睦碚撘饬x，具有很大的應(yīng)用潛力。

由于異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)基含有豐富的有機碳，因此，異樣培養(yǎng)的小球藻較易產(chǎn)生細(xì)菌污染，導(dǎo)致小球藻培養(yǎng)失敗或者影響小球藻的品質(zhì)。常規(guī)的污染細(xì)菌檢測使用基于分離培養(yǎng)的平板計數(shù)(周德慶著，微生物學(xué)教程，高等教育出版社；1991，184-202)，耗時耗力，準(zhǔn)確度不高，不能滿足快速檢測和實時檢測的要求。因此，開發(fā)不依賴于分離培養(yǎng)的污染細(xì)菌的動態(tài)、快速分子檢測技術(shù)迫切而重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種異養(yǎng)小球藻中污染細(xì)菌動態(tài)的分子檢測方法，能準(zhǔn)確、快速地對異養(yǎng)培養(yǎng)條件下小球藻污染細(xì)菌進行分析檢測。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過酚/氯仿方法提取培養(yǎng)不同時間的異養(yǎng)小球藻污染細(xì)菌的總DNA；以提取的異養(yǎng)小球藻污染細(xì)菌的總DNA為模板，用27f/1492r引物進行細(xì)菌16S?rRNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴增；以16S?rRNA擴增產(chǎn)物為模板，以16S?rRNA-V3區(qū)的358f/907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp的擴增產(chǎn)物；將550bp的擴增產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，獲取變性梯度凝膠電泳圖譜；通過對圖譜上的不同條帶進行回收、聚合酶鏈反應(yīng)擴增、克隆測序、同源性分析檢測細(xì)菌種類，實現(xiàn)異養(yǎng)小球藻不同培養(yǎng)時間的污染細(xì)菌檢測。

本發(fā)明的方法具體步驟如下：

1、通過酚/氯仿方法提取不同培養(yǎng)時間的異養(yǎng)小球藻污染細(xì)菌的總DNA。

2、以提取的異養(yǎng)小球藻污染細(xì)菌的總DNA為模板，用27f/1492r引物進行細(xì)菌16S?rRNA的聚合酶鏈反應(yīng)擴增；以16S?rRNA擴增產(chǎn)物為模板，以16SrRNA-V3區(qū)的358f/907rm帶有GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp的擴增產(chǎn)物。

3、將550bp的擴增產(chǎn)物加入到w/v為6％的聚丙烯酰胺凝膠中，進行變性梯度凝膠電泳，變性梯度從上到下為35％-55％，電泳溫度保持60℃，電壓150V，電泳6小時；電泳結(jié)束后，凝膠染色，拍照獲取變性梯度凝膠電泳圖譜。

4、將變性梯度凝膠電泳圖譜中的優(yōu)勢條帶割下，以358f/907rm不帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，獲得550bp片段；對550bp片段進行割膠純化，純化后的550bp片段與PUCm-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞接種到涂有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的平板上，37℃培養(yǎng)12-18小時，挑取白色菌落，用PUCm-T載體引物T7/M13進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，對擴增結(jié)果陽性的菌落進行測序；對測得的序列進行Blast分析，獲得異養(yǎng)小球藻中污染細(xì)菌動態(tài)的檢測結(jié)果。

采用本發(fā)明方法，可以準(zhǔn)確、高效、動態(tài)、快速地對小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中不同培養(yǎng)時間的污染細(xì)菌進行檢測，克服了傳統(tǒng)的平板計數(shù)檢測方法的檢測速度慢、準(zhǔn)確度不高、檢測前需要細(xì)菌培養(yǎng)等缺點。

本發(fā)明適合微藻培養(yǎng)過程中污染細(xì)菌的動態(tài)檢測。