[發明專利]異養小球藻中污染細菌動態的分子檢測方法

無效

• 申請號: 200910196272.2
• 申請日: 2009-09-24
• 公開（公告）號: CN101665836A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 錢文倩;李志勇;張風麗;繆曉玲
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/19;C12R1/07;C12R1/125
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 毛翠瑩

1、一種異養小球藻中污染細菌動態的分子檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

1)通過酚/氯仿方法提取不同培養時間的異養小球藻污染細菌的總DNA；

2)以提取的異養小球藻污染細菌的總DNA為模板，用27f/1492r引物進行細菌16S?rRNA的聚合酶鏈反應擴增；以16S?rRNA擴增產物為模板，以16SrRNA-V3區的358f/907rm帶有GC發夾結構的引物進行聚合酶鏈反應擴增，獲得550bp的擴增產物；

3)將550bp的擴增產物加入到w/v為6％的聚丙烯酰胺凝膠中，進行變性梯度凝膠電泳，變性梯度從上到下為35％-55％，電泳溫度保持60℃，電壓150V，電泳6小時；電泳結束后，凝膠染色，拍照獲取變性梯度凝膠電泳圖譜；

4)將變性梯度凝膠電泳圖譜中的優勢條帶割下，以358f/907rm不帶GC發夾結構的引物進行聚合酶鏈反應擴增，獲得550bp片段；對550bp片段進行割膠純化，純化后的550bp片段與PUCm-T載體連接，連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞中；將轉化后的大腸桿菌感受態細胞接種到涂有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的平板上，37℃培養12-18小時，挑取白色菌落，用PUCm-T載體引物T7/M13進行聚合酶鏈反應擴增，對擴增結果陽性的菌落進行測序；對測得的序列進行Blast分析，獲得異養小球藻中污染細菌動態的檢測結果。