[發明專利]一種定量檢測AKAP12甲基化水平的方法及其應用

有效

• 申請號: 200910196054.9
• 申請日: 2009-09-22
• 公開（公告）號: CN102021233A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 劉維薇;關明;呂元;李敏;劉春芳;林勇
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術領域

本發明屬表觀遺傳學領域，涉及腫瘤的基因診斷，具體涉及AKAP12基因啟動子區域的甲基化，尤其對人AKAP12基因甲基化程度的檢測。

背景技術

DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在胞嘧啶堿基上的第5位碳原子上增加一個甲基，使其轉變為5-甲基胞嘧啶(mC)的一種反應。發生在腫瘤中的甲基化現象，最主要的特點是全基因組的低甲基化和局部位點的高甲基化并存，例如啟動子區域的CpG島。這一現象既被認為是腫瘤抑癌基因失活的機制之一，也是腫瘤良惡性轉化的重要判別標志。由于抑癌基因發生改變往往要早于細胞的惡性增生，因此檢測抑癌基因的狀態可以用于腫瘤發生的早期預測。

以往的一些研究表明在腫瘤組織、外周血(血漿/血清)、腫瘤累及器官相關的體液(如唾液、痰等)中均可以發現腫瘤相關的甲基化DNA，癌變細胞可以釋放DNA到外周血或者體液中，因而可以檢測到腫瘤相關基因的啟動子異常甲基化。一項對肺癌患者血清中游離循環DNA的檢測發現，大多數的肺癌患者血清中都存在一些基因啟動子區高甲基化的現象(文獻1)。同樣Valenzuela等也發現在膀胱癌患者血清中和基因啟動子異常甲基化高度相關(文獻2)。外周血中高水平的游離DNA，特別DNA的高甲基化現象，常常與腫瘤的發生、發展、對治療的反應性以及預后等都密切相關，因而可能將高甲基化作為腫瘤篩查、早期診斷、監測轉移，預后復發的標記物，并能有助于早期發現有癌變傾向的細胞(文獻3-5)。

檢測外周血中抑癌基因甲基化水平，作為腫瘤的標記物具有很大潛力，因為甲基化分子標記物擁有以下明顯的優勢：1，通常甲基化會以“多發”的形式發生在一種腫瘤中，因此，挑選一些位點進行檢測就能反映全部基因的狀態。2，高甲基化通常發生在相同的基因區域，所以容易鎖定目標。3，高甲基化發生在DNA水平，可以避免檢測RNA或者免疫組化帶來的其他因素的干擾。4，異常的結果是一個陽性的信號，能減少正常細胞的污染帶來的困擾(文獻6)。如Ellinger?J等監測了膀胱癌患者血清中APC，DAPK，GSTP1，PTGS2，TIG1和Reprimo的甲基化DNA，發現三個基因(APC，GSTP1?and?TIG1)的甲基化有助于膀胱癌的診斷和預后，對膀胱癌具有潛在的診斷價值。

A激酶錨定蛋白12(AKAP12/AKAP250/Gravin)位于6q24-q25，主要分布為細胞質中。最初是從重癥肌無力的患者血清中得到的(文獻7)，屬于細胞特異性的AKAP。AKAP12主要參與PKA和PKC復合物的形成(文獻8)，同時亦是一重要的β2腎上腺素受體復合物的調節基因(文獻9)，并參與了蛋白定向、信號轉導以及G蛋白偶聯受體蛋白信號轉導途徑。最近的一些研究顯示，AKAP12基因除了在多條信號通路中扮演重要的角色之外，還在多種腫瘤中缺失，例如黑素瘤(文獻10)、乳腺癌(文獻11)、前列腺癌(文獻12)、胃癌(文獻13)以及慢性淋巴細胞性白血病(文獻14)等。同時Choi等人(文獻13)在胃癌研究中首先報導了將異常的DNA甲基化與AKAP12表達缺失相對應。提示這可能是一個重要的腫瘤生長的負調節基因，這個基因可能是一個潛在的治療基因，也有可能是一個有用的腫瘤生物標志物(文獻13)。

參考文獻：

1.Pan?H，Califano?J，Ponte?JF，et?al.Loss?of?heterozygosity?patternsprovide?fingerprints?for?genetic?heterogeneity?in?multistep?cancer?progression?oftobacco?smoke-induced?non-small?cell?lung?cancer.Cancer?Res?2005；65：1664-9.

2.Valenzuela?MT，Galisteo?R，Zuluaga?A，et?al.Assessing?the?use?ofp16(INK4a)promoter?gene?methylation?in?serum?for?detection?of?bladder?cancer.EurUrol?2002；42：622-8.

3.Esteller?M，Fraga?MF，Paz?MF，et?al.Cancer?epigenetics?and?methylation.Science?2002；297：1807-8.