[發(fā)明專利]利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細(xì)胞的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910195924.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN102021141A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祝加學(xué);沈尊理;秦金保;沈華;張兆峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市第一人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/06
• 分類號(hào): C12N5/06
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

許旺細(xì)胞(Schwann?cells，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中重要的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，由Schwann(1939)首先發(fā)現(xiàn)，在有髓神經(jīng)纖維髓鞘化，損傷神經(jīng)修復(fù)中起到重要的作用。也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的重要來源，能夠分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CNTF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等。成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)損傷的軸突欠缺再生能力，但周圍神經(jīng)損傷后，軸突再生能力較為強(qiáng)大，有學(xué)者認(rèn)為，這種軸突再生能力的差異是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)自身的微環(huán)境不適宜軸突再生。進(jìn)一步研究表明，將周圍神經(jīng)移植至中樞神經(jīng)后，軸突能再生長(zhǎng)入周圍神經(jīng)內(nèi)，而起關(guān)鍵作用的成分正是SCs.說明SCs不僅在周圍神經(jīng)損傷后，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，髓鞘化起到關(guān)鍵的作用，再中樞神經(jīng)的損傷修復(fù)中也有重要的作用。

體外培養(yǎng)許旺細(xì)胞的組織來源以坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)最為常用。3-5天內(nèi)的新生乳鼠和胚胎鼠來源的神經(jīng)細(xì)小，柔嫩，脆而易斷，且剝離外膜困難，束膜更是無(wú)法剝離。出生6天后至成年鼠神經(jīng)來源的施萬(wàn)細(xì)胞增殖能力較弱，采用體外體內(nèi)預(yù)變處理比較耗時(shí)，且增殖能力仍然不是很理想。出生3～5天的SD乳鼠，取材容易，且許旺細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，我們?cè)O(shè)計(jì)采用混合酶分步消化法剝脫神經(jīng)外膜和束膜，操作簡(jiǎn)單，剝離徹底，獲得原代許旺細(xì)胞的純度就可以達(dá)到80％以上。

在體外培養(yǎng)許旺細(xì)胞擴(kuò)增傳代的過程中，成纖維細(xì)胞污染仍然是主要問題，且當(dāng)在體外培養(yǎng)48小時(shí)后，成纖維細(xì)胞的增殖速度明顯快于許旺細(xì)胞，如果不進(jìn)行純化，成纖維細(xì)胞將成為主要的細(xì)胞擠占許旺細(xì)胞的生長(zhǎng)空間，影響許旺細(xì)胞的增殖。目前純化施萬(wàn)細(xì)胞的方法主要有：差速貼壁法、抗有絲分裂法和免疫溶解法等。差速貼壁法是利用在預(yù)鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，成纖維細(xì)胞比施萬(wàn)細(xì)胞更易貼壁的特點(diǎn)，來達(dá)到純化的目的，不會(huì)損傷施萬(wàn)細(xì)胞。抗有絲分裂法用抗有絲分裂劑，如Ara2c，G?2418等殺死增殖迅速的成纖維細(xì)胞，但同時(shí)也對(duì)施萬(wàn)細(xì)胞有毒性作用，而且操作過程也比較繁瑣。免疫溶解法是通過使用成纖維細(xì)胞所特有的抗原抗體，如Thy-1等，結(jié)合使用補(bǔ)體，以消除成纖維細(xì)胞。但由于補(bǔ)體的非特異性作用可損傷細(xì)胞，且該試劑昂貴，不適宜做大量細(xì)胞的培養(yǎng)，另外還有免疫磁珠，流式細(xì)胞儀分選法等，但是以上方法普遍存在，耗時(shí)，費(fèi)力，步驟繁瑣或需要大型設(shè)備且純化效果不理想等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)易、高效的分離、純化許旺細(xì)胞的方法。尤其涉及一種利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

具體而言，本發(fā)明提供了一種利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細(xì)胞的方法，其包括下述步驟：

(1)無(wú)菌情況下剝離神經(jīng)段的神經(jīng)外膜，切碎神經(jīng)段并置于DMEM培養(yǎng)基中清洗，離心棄上清；

(2)用3～5倍組織量的質(zhì)量體積比為0.05～0.3％的消化酶溶液消化神經(jīng)碎塊30～60分鐘；所述的消化酶是酵素酶、膠原酶NB4或者兩者的混合液；

(3)將步驟(2)得到的混懸液用吸管反復(fù)吹打3～5分鐘；

(4)以600g離心5～10分鐘，棄上清，得到細(xì)胞團(tuán)塊；

(5)用許旺細(xì)胞培養(yǎng)液重懸步驟(4)得到的細(xì)胞，即可。

上述方法中，所述的神經(jīng)碎塊體積為0.5-1.5mm³。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中神經(jīng)碎塊體積平均為1mm³。

上述方法中，步驟(1)的DMEM培養(yǎng)基體積是神經(jīng)碎塊體積的3-7倍。

上述方法中，步驟(2)中消化酶可以使用酵素酶和膠原酶NB4的混合液。混合液中，膠原酶NB4的濃度較好為0.1～0.2％，例如0.1、0.15％、0.18％、0.2％；酵素酶的濃度較好為0.05～0.1％。

上述方法中，步驟(2)中消化酶混合酶的溶液是DMEM培養(yǎng)基。