[發明專利]利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細胞的方法無效
| 申請號： | 200910195924.0 | 申請日： | 2009-09-18 |
| 公開（公告）號： | CN102021141A | 公開（公告）日： | 2011-04-20 |
| 發明（設計）人： | 祝加學;沈尊理;秦金保;沈華;張兆峰 | 申請（專利權）人： | 上海市第一人民醫院 |
| 主分類號： | C12N5/06 | 分類號： | C12N5/06 |
| 代理公司： | 上海正旦專利代理有限公司 31200 | 代理人： | 吳桂琴 |
| 地址： | 20008*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 膠原酶 酵素 分離 純化 細胞 方法 | ||
1.一種利用膠原酶和酵素酶分離、純化許旺細胞的方法，其特征在于，其包括下述步驟：
(1)無菌情況下剝離神經段的神經外膜，切碎神經段并置于DMEM培養基中清洗，離心棄上清；
(2)用3～5倍組織量的質量體積比為0.05～0.3％的消化酶溶液消化神經碎塊30～60分鐘；所述的消化酶是酵素酶、膠原酶NB4或者兩者的混合液；
(3)將步驟(2)得到的混懸液用吸管反復吹打3～5分鐘；
(4)以600g離心5～10分鐘，棄上清，得到細胞團塊；
(5)用許旺細胞培養液重懸步驟(4)得到的細胞，即可。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述的神經碎塊體積為0.5-1.5mm3。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(1)的DMEM培養基體積是神經碎塊體積的3-7倍。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是消化酶溶液中膠原酶NB4的濃度為0.1～0.2％。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是消化酶溶液中酵素酶的濃度為0.05～0.1％。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是消化酶的溶劑是DMEM培養基。
7.根據權利要求1所述方法的應用，其特征是將所得的許旺細胞依次經過下述步驟進行擴增：
A.將權利要求1所得的許旺細胞種植于培養瓶，培養48～72小時；
B.消化細胞，收集細胞混懸液，以600g離心5～10分鐘，棄去上清；
C.用許旺細胞培養液重懸步驟B得到的細胞，培養48～72小時即可。
8.如權利要求7所述的應用，其特征是細胞種植于培養瓶的密度為2～4×104細胞/ml。
9.如權利要求7所述的應用，其特征是所述的消化細胞是：吸去培養液，加入2～3ml質量體積比為0.06～0.1％的酵素酶，置37℃、5％CO2培養箱作用15～30分鐘；然后水平輕輕振蕩所得細胞。
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