[發明專利]一種植物總蛋白提取液及其應用

無效

• 申請號: 200910193331.0
• 申請日: 2009-10-27
• 公開（公告）號: CN101696238A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 張二華;梁炫強;陳小平
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/14
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明涉及蛋白質組學研究領域中的蛋白提取方法，具體涉及一種植物總 蛋白提取提取液及其應用。

背景技術

現在植物蛋白的提取方法很多，最常用為TCA/丙酮沉淀法和酚提法。TCA/ 丙酮能有效抑制樣品中各種酶的活性，但得到的蛋白經常會難以再溶解，并且 會含有較多的雜質而不適于用雙向電泳(2-DE)來分析。酚提法通常需要先用 一種緩沖液從植物樣品中溶出蛋白，再以苯酚從緩沖液中抽提蛋白，它可以通 過用緩沖液反復抽提以除去酚相中雜質，得到的蛋白會比較純凈，但會受到蛋 白在緩沖液中溶解能力的限制而丟失一些蛋白，從而影響到2-DE的最終結果。 此外，在緩沖液中由于酶的活力無法被完全抑制，也會導致一些蛋白被修飾或 降解。直接用緩沖液提取蛋白的方法更無法去除樣品中水溶性雜質如色素、多 糖及多酚等。這些物質會嚴重干擾到蛋白質的電泳，所以應用范圍更加有限。 植物材料中廣泛存在的雜質對SDS-PAGE電泳的影響可能不大，但卻會嚴重干 擾到等電聚焦的過程，導致2-DE圖像中出現嚴重的拖尾、橫縱紋及彌散現象。 進而影響到對2-DE圖像的對比分析以及蛋白質的質譜鑒定，所以在制備用于 2-DE的蛋白質樣品時，需盡可能去除一切雜質。

發明內容

針對現有技術中存在的缺點和不足，本發明的目的首先是提供一種植物總 蛋白提取液。

本發明的另一目的是提供上述植物總蛋白提取液的具體應用。

為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案：

一種植物總蛋白提取液，其特征在于：是含有重蒸酚和還原劑的水溶液； 其中，，重蒸酚的重量含量為80-90％，還原劑的重量含量為0.2-3％，還原 劑為巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。

優選地，所述巰基乙醇含量為1-3％(v/v)，所述二硫蘇糖醇的含量為0.2 -1％(w/v)。

優選的，所述植物總蛋白提取液是含2％體積的巰基乙醇和85％重量的重 蒸酚的水溶液。

本發明還提供根據所述植物總蛋白提取液的應用，廣泛用于各種植物組織 樣品特別是含雜質如色素、多糖、多酚較多的植物葉片、根、果實、塊莖(根) 等的蛋白質組學研究。

作為一種具體的應用，本發明還提供一種植物總蛋白提取方法，包括以下 具體步驟：

(1)將植物組織在液氮中研磨粉碎，用-20℃預冷的含10-15％重量的三 氯乙酸(TCA)的三氯乙酸/丙酮溶液連續洗滌至上清澄清透明，再以丙酮洗除 殘留三氯乙酸，晾干備用；對于油脂豐富的干果類材料(如花生、大豆、果仁 等)，將材料粉碎后直接用有機溶劑(如環己烷石油醚)抽提脫脂，然后晾干有 機溶劑后備用；

(2)以1-5ml/克植物鮮重的比例加入權利要求1、2或3中所述的植物 總蛋白提取液，旋渦混合1分鐘，室溫靜置；旋渦混合一般1分鐘足夠，室溫 靜置優選至少10分鐘；

(3)于4℃、10,000g離心至少20分鐘，吸取上層酚相；下層沉淀可依 步驟(2)重復抽提2-3次，合并所得酚相；

(4)將收集到的酚相與5-10倍體積-20℃預冷的含0.1M醋酸銨的甲醇 混合，置于0至-20℃沉淀至少10分鐘；

(5)于4℃、10,000g離心至少20分鐘，棄上清，沉淀用無水甲醇洗滌 3-5次，晾干或凍干即得植物蛋白干粉。

優選地，所述步驟(1)中，三氯乙酸/丙酮溶液中三氯乙酸的重量含量為 10％。。

優選地，所述步驟(2)中，植物總蛋白提取液的添加比例為2-4ml/克植 物鮮重；抽提時間為10分鐘。

優選地，所述步驟(3)中，所述重復抽提為3次。

優選地，所述步驟(4)為，將收集到的酚相加5-6倍體積的-20℃預冷的 含0.1M醋酸銨的甲醇，沉淀溫度為-20℃；沉淀時間為10分鐘。

優選地，所述步驟(5)中，沉淀洗滌次數為3次。

相比現有技術，本發明具有如下優點：

本發明的蛋白提取液主要由苯酚組成。直接利用苯酚從植物組織干粉中抽 提蛋白，可減少因一些蛋白在緩沖液中難溶而無法提取的問題；使制備的樣品 更能全面反映研究對象中蛋白的組成，本發明可廣泛用于各種植物組織樣品特 別是色素、多糖、多酚類含量較多的植物葉片、根、果實、塊莖等組織的蛋白 質組學研究，應用前景十分廣闊。

附圖說明