[發明專利]一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法

有效

• 申請號: 200910193090.X
• 申請日: 2009-10-16
• 公開（公告）號: CN101671738A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 何自福;佘小漫;虞皓;羅方芳
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N27/447;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘 暉

1.一種快速檢測鑒定茄科青枯菌(Ralstonia?solanacearum)侵染引起的 青枯病的方法，包括以下操作步驟：

(1)檢測病樣品的準備：用水沖洗干凈待檢病樣品的莖基部和根部， 從莖基部取一小塊大小為1.5～2mm×2.5～3mm的維管束組織；

(2)肉眼觀察病樣組織在載玻片水滴中表型：吸取80～100μL的滅菌 水，滴在干凈的載玻片上，將步驟(1)中維管束組織放入載玻片的水滴中， 并壓入水滴中，靜置，觀察有無霧狀菌濃從病樣組織中噴出；如有，繼續下 一步試驗，如無，說明該病樣品不是由茄科青枯菌侵染引起的；

(3)PCR進一步檢測驗證：取步驟(2)的水滴里病樣組織噴出的霧狀 菌濃作為模板，進行PCR反應；所述上游引物為5′-atgattctgcggcctacgcggcat -3′，所述下游引物為5′-agtcgggtctggcgtcgaccatcaa-3′；

(4)結果鑒別：將步驟(3)所得的反應產物在瓊脂糖凝膠上電泳；在 凝膠成像系統中觀察，如有517bp大小的特異性條帶，即確認病樣品是由茄 科青枯菌侵染引起的，如無該特異條帶，則該病樣品不是茄科青枯菌侵染引 起的。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，步驟(3)中所述PCR反應是從步驟(2)的水 滴里的病樣組織噴出的霧狀菌濃中吸取1μL作為模板，加入到PCR管中， 再分別加入1單位Taq酶、200μmol/L脫氧核糖核苷酸、上游引物及下游引 物各0.5μmol/L、1倍PCR反應緩沖液，用雙蒸水補足至總體積為25μL， 于PCR儀中進行PCR反應。

3.根據權利要求1所述的一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，步驟(3)所述PCR反應條件為94℃預變性4min， 94℃變性1min、52℃退火45s、72℃延伸50s，30個循環，最終延伸10min。

4.根據權利要求1所述的一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，步驟(4)中反應產物是在質量體積百分比為0.8～ 1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，50～75V恒壓電泳50～70min。

5.根據權利要求1所述的一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵染引起的青 枯病的方法，其特征在于，所述待檢病樣品為茄科青枯菌侵染引起的茄子、 番茄、花生、馬鈴薯、辣椒、煙草、空心菜、沙姜、菊花或桑樹的病樣組織。