[發(fā)明專利]一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵染引起的青枯病的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910193090.X
• 申請日: 2009-10-16
• 公開（公告）號: CN101671738A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何自福;佘小漫;虞皓;羅方芳
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N27/447;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 裘 暉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病害鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的青枯病的快速檢測鑒定方法。

背景技術(shù)

對于茄科青枯菌侵染引起的青枯病檢測鑒定，現(xiàn)有技術(shù)有三種：傳統(tǒng)的 植物病原細(xì)菌分離鑒定方法、BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)和梅里埃微生物鑒定 方法。

傳統(tǒng)的植物細(xì)菌性青枯病鑒定方法，主要包括從病樣中分離病原菌、獲 得分離菌株的純培養(yǎng)、菌落與菌體形態(tài)特征觀察、生理生化特性測定和致病 性測定等步驟，該鑒定過程至少需要1個月以上，工作量大，鑒定時間長， 而且專業(yè)性強。

至于目前市面上銷售的國外進(jìn)口的微生物鑒定系統(tǒng)，代表性的有美國 BIOLOG公司和法國梅里埃公司開發(fā)的微生物鑒定系統(tǒng)。前者是以檢測微生 物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的酶與四唑類物質(zhì)發(fā)生顏色 反應(yīng)和濁度差異為基礎(chǔ)，建立起指紋圖譜與微生物種類相反應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，通 過智能軟件將待鑒定微生物的圖譜與數(shù)據(jù)庫參比，得出鑒定結(jié)果。后者是根 據(jù)不同微生物的理化性質(zhì)不同，采用光電比色法，測定微生物分解底物導(dǎo)致 pH改變而產(chǎn)生的不同顏色，來判斷反應(yīng)的結(jié)果，與種數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌的生物 模型相比較，得到相似系統(tǒng)鑒定值。上述這二種鑒定系統(tǒng)的鑒定過程均需要 18小時以上，還需要購買昂貴的進(jìn)口專用鑒定材料和儀器設(shè)備，而且該系 統(tǒng)主要適用于人、動物及環(huán)境微生物鑒定，少見用于植物病原微生物的鑒定， 目前文獻(xiàn)也未見有用于茄科青枯病鑒定的報道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡 便、快速準(zhǔn)確、成本低廉的茄科青枯病鑒定方法。本發(fā)明將病樣特殊表癥與 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)有機地結(jié)合起來，以茄科青枯菌特有的FliC 基因(裝配茄科青枯菌鞭毛的主要基因之一，F(xiàn)liC基因在茄科青枯菌鞭毛裝 配中的位置及作用如圖1所示)序列設(shè)計特異性引物，建立茄科青枯菌PCR 反應(yīng)體系，結(jié)合受茄科青枯菌侵染的植物病組織在水介質(zhì)中所表現(xiàn)的噴霧特 征進(jìn)行鑒別，結(jié)果可靠，可應(yīng)用到實際生產(chǎn)中，對植物病害進(jìn)行準(zhǔn)確有效的 快速檢測。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種快速檢測鑒定茄科青枯菌侵 染引起的青枯病的方法，包括以下操作步驟：

(1)檢測病樣品的準(zhǔn)備：用水沖洗干凈待檢病樣品的莖基部和根部， 從莖基部取一小塊大小為1.5-2mm×2.5-3mm的維管束組織；

(2)肉眼觀察病樣組織在載玻片水滴中表型：吸取80～100μL的滅菌 水，滴在干凈的載玻片上，將步驟(1)中維管束組織放入載玻片的水滴中， 并稍用力壓入水滴中，靜置，觀察有無霧狀菌濃從病樣組織中噴出；如有， 繼續(xù)下一步試驗，如無，說明該病樣品不是由茄科青枯菌侵染引起的；

(3)PCR進(jìn)一步檢測驗證：從上述水滴里的病樣組織噴出的霧狀菌濃 作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述上游引物為5′-atgattctgcggcctacgcggcat-3′， 所述下游引物為5′-agtcgggtctggcgtcgaccatcaa-3′；

(4)結(jié)果鑒別：將步驟(3)所得的反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳；在 凝膠成像系統(tǒng)中觀察，如有517bp大小的特異性條帶，即確認(rèn)病樣品是由 茄科青枯菌侵染引起的，如無該特異條帶，則該病樣品不是茄科青枯菌侵染 引起的。

步驟(2)中所述茄科青枯菌侵染引起的病樣品維管束組織在水中肉眼 可見“噴霧”現(xiàn)象。

步驟(3)中所述PCR反應(yīng)是從上述水滴里的病樣組織噴出的霧狀菌濃 中吸取1μL作為模板，加入到PCR管中，再分別加入1單位(U)Taq酶、 200μmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTP)、上游引物及下游引物各0.5μmol/L、1 倍PCR反應(yīng)緩沖液，用雙蒸水補足至總體積為25μL，于PCR儀中進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

步驟(3)所述PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min、 52℃退火45s、72℃延伸50s，30個循環(huán)，最終延伸10min。

步驟(4)中反應(yīng)產(chǎn)物是在質(zhì)量體積百分比為(w/v)0.8～1.5％的瓊脂 糖凝膠上電泳，50～75V恒壓電泳50～70min。

所述待檢病樣品為茄科青枯菌侵染引起的茄子、番茄、花生、馬鈴薯、 辣椒、煙草、空心菜、沙姜、菊花或桑樹等病樣組織。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：