[發明專利]檢測醬油中大豆轉基因成分的試劑盒及其使用方法

無效

• 申請號: 200910192637.4
• 申請日: 2009-09-23
• 公開（公告）號: CN101659998A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發明（設計）人: 姚曉慶;周霞;趙華福;張文慶
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘 暉

1.一種檢測醬油中轉基因大豆成分的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包 含醬油DNA提取試劑和PCR檢測引物；

所述醬油DNA提取試劑由溶液I、溶液II、溶液III、溶液IV和溶液V組成； 溶液I為pH?8.0，100mmol/L的三(羥基)氨基甲烷鹽酸鹽溶液；溶液II為DNA 提取緩沖液，內含pH8.0、20mmol/L的乙二胺四乙酸、500mmol/L的NaCl和 質量體積比為1.5％的十二烷基硫酸鈉；溶液III包含質量體積比為2％的十六烷 基三甲基溴化銨和體積百分比為0.2％的β-巰基乙醇；溶液IV為1.5mol/L的鹽酸 胍溶液；溶液V為20μg/ml的蛋白酶K溶液；

所述PCR檢測引物由檢測大豆內標基因的引物與檢測轉基因外標基因的引 物組成；

所述的轉基因外標基因為抗草甘膦基因、CaMV?35S啟動子或NOS終止子 中的至少一種；

所述抗草甘膦基因的PCR引物如下：

eps-1：5’-ATGGCTCAAGGGATACAAACC-3’

eps-2：5’-ACCGCCGAACATGAAGGA-3’；

所述CaMV?35S啟動子的PCR引物如下：

35S-1：5’-ATTGTGCGTCATCCCTTAC-3’

35S-2：5’-CCGACAGTGGTCCCAAAGA-3’；

所述NOS終止子的PCR引物如下：

NOS-1：5’-CGTCATGGGCCTCGTGTCGG-3’

NOS-2：5’-AGTAACATAGATGACACC-3’。

2.根據權利要求1所述檢測醬油中轉基因大豆成分的試劑盒，其特征在于： 所述的大豆內標基因為大豆凝集素基因。

3.根據權利要求2所述檢測醬油中轉基因大豆成分的試劑盒，其特征在于： 所述大豆凝集素的PCR引物如下：

lec-1：5’-TGGTGGAGGCATCATAG-3’

lec-2：5’-ACCCAGAATGTGGTTGTAT-3’。

4.權利要求3所述試劑盒的使用方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)樣品的預處理：醬油與無水乙醇按體積比1∶(3～3.5)混勻，冷卻至 -20℃維持10～12分鐘，4℃?10000rpm離心10分鐘，棄上清；在沉淀中加入3倍醬 油體積的溶液I，迅速混勻，攪拌1.5～2小時，室溫12000rpm離心10分鐘，棄上 清；

(2)樣品DNA的提取：

A、在步驟(1)所得樣品沉淀中加入溶液II、溶液IV和溶液V，溶液II、 溶液IV和溶液V的加入量分別為醬油體積的80/1000～85/1000、10/1000～ 15/1000和8/1000～8.5/1000；再加入預熱至65℃的溶液III，溶液III的加入量為醬 油體積的15/1000～20/1000；

B、接著，65℃水浴30分鐘，加入與步驟A最終得到的溶液等體積的體積比 為24∶1的氯仿∶異戊醇溶液，4℃振蕩10分鐘，15000rpm離心10分鐘，取上清液， 重復氯仿∶異戊醇溶液抽提步驟至少一次；

C、在上清液中加入2/3上清液體積的異丙醇，于-20℃沉淀DNA?2小時， 6000rpm離心6分鐘收集DNA沉淀；加入500～550μl?70％乙醇輕柔漩渦打散DNA 沉淀，6000rpm離心6分鐘收集DNA沉淀，再加入300μl無水乙醇洗滌DNA沉淀； 待無水乙醇揮發完全后，將DNA重溶解于20～30μl三羥甲基氨甲烷緩沖液，得 到醬油總DNA；

(3)PCR檢測：

PCR反應體系總體積為25μl，其中成分有：

PCR擴增條件如下：預變性：94℃?5分鐘；循環反應：94℃變性30秒，58℃ 退火30秒，72℃延伸1分鐘，共30個循環；最后72℃延伸8分鐘，4℃保存。

5.根據權利要求4所述試劑盒的使用方法，其特征在于：所述水為雙蒸水、 三蒸水或超純水。