[發明專利]一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法

無效

• 申請號: 200910192440.0
• 申請日: 2009-09-18
• 公開（公告）號: CN101812427A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 冉丕鑫;王健;田艷;陳豫欽;蔣永亮;萬利梅
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院;呼吸疾病國家重點實驗室
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 張文雄

1.一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：包括獲取原代培養的大鼠氣道平滑肌細胞和獲取傳代培養的大鼠氣道平滑肌細胞二個步驟，

1)將大鼠氣管中膜用消化液在30℃～45℃消化15～30min后收集氣道平滑肌細胞，進行原代細胞培養，獲取原代培養的大鼠氣道平滑肌細胞；

2)當原代細胞達到90％融合密度后，用PBS溶液清洗，加入0.2～0.25％胰蛋白酶溶液室溫消化1～2分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，清洗細胞，加入混合培養液，輕輕吹打使之形成細胞懸浮液，按1∶2接種于新的培養瓶中進行培養，3～5天至細胞生長至對數生長期，獲取傳代培養的大鼠腔靜脈平滑肌細胞。

2.根據權利要求1所述的一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：所述消化液由HBSS平衡鹽溶液、I型膠原酶、牛血清白蛋白和二硫蘇糖醇按比例配制而成。

3.根據權利要求1所述的一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：所述消化液為：在5mlHBSS平衡鹽溶液中加入31mg?I型膠原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫蘇糖醇配制而成。

4.根據權利要求2所述的一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：所述消化液其配制方法是：在5mlHBSS平衡鹽溶液中加入39.5～40.5mgI型膠原酶、9.5～10.5mg牛血清白蛋白和0.65～0.75mg二硫蘇糖醇混合配制而成。

5.根據權利要求1所述的一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：步驟1)所述獲取原代培養的大鼠氣道平滑肌細胞的具體步驟如下：

1)快速取出大鼠心肺組織放入含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液中洗除血污；將心肺組織置于體視顯微鏡下，沿氣管解剖結構快速鈍性分離氣管周圍組織并反復用HBSS沖洗使視野清晰；將氣管剪下放入HBSS平衡鹽溶液中反復漂洗至組織干凈光滑，利用顯微外科鑷剝離氣管外脂肪和纖維組織外膜，剪開氣管，刮除氣管內外膜至其光滑為止，用HBSS平衡鹽溶液反復沖洗去除內皮細胞；

2)取出中膜平滑肌層組織，并放入含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液中漂洗多次至組織干凈透明，然后用消化液在30℃～45℃消化中膜組織25～30min，見組織塊松軟、邊緣發毛，呈一定程度的破碎狀；

3)加入混合培養液中和消化液，收集細胞懸浮液并離心，棄上清液后加入混合培養液調整細胞密度以1～2×10⁵細胞/ml的密度種植于培養板中，置于30℃～45℃、5％CO₂培養箱內靜置培養，3～4天后換培養液，當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的大鼠氣道平滑肌細胞。

6.根據權利要求5所述的一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：所述混合培養液中含有95～105U/ml的青霉素、95～105U/ml的鏈霉素和10～20％胎牛血清，為低糖DMEM培養液。

7.根據權利要求1所述的一種大鼠氣道平滑肌細胞的培養方法，其特征是：所述胰蛋白酶溶液中含有0.02％乙二胺四乙酸EDTA；所述細胞接種密度為1～2×10⁵個/ml。