[發(fā)明專利]一種大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910192440.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-18
• 公開（公告）號(hào): CN101812427A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 冉丕鑫;王健;田艷;陳豫欽;蔣永亮;萬利梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)學(xué)院;呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號(hào): C12N5/06
• 分類號(hào): C12N5/06
• 代理公司: 廣州廣信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44261
• 代理人: 張文雄

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是一種大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，是以氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞為主要臨床特征，而氣道的異常改變是作為哮喘的重要病理特征。氣道平滑肌細(xì)胞是探尋COPD、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞材料，體外氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞株的建立是研究細(xì)胞生物學(xué)行為，是研究疾病發(fā)病機(jī)制及其防治手段的基礎(chǔ)。因此找到一種簡(jiǎn)便、高效的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病方面的研究具有十分重要的意義。目前，氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的方法主要有貼塊法和酶消化法。其中，貼塊法雖然操作簡(jiǎn)單，但是周期太長(zhǎng)，且對(duì)組織的分離要求高，當(dāng)分離不佳時(shí)，細(xì)胞難以爬出。而且由于以下原因?qū)е乱源笫髿獾罏槠交〖?xì)胞來源的細(xì)胞培養(yǎng)受到限制：1、大鼠體形較小，心肺組織更小，用常規(guī)分離牛、豬等大型動(dòng)物動(dòng)脈的方法來分離大鼠氣道難度較大、不易成功；2.分離到的大鼠氣管較動(dòng)脈彈性差，周圍纖維結(jié)締組織多而且黏附緊密，外膜、中膜及內(nèi)膜無明顯過度分界；3.中膜平滑肌層較主動(dòng)脈薄，平滑肌細(xì)胞較主動(dòng)脈肺動(dòng)脈少，一般的方法培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞萌出時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)非常緩慢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了提供一種高效、簡(jiǎn)便、純度高、成本低的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是：包括獲取原代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞和獲取傳代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞二個(gè)步驟，

1)將大鼠氣管中膜用消化液在30℃～45℃消化14～30min后收集氣道平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲取原代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞；

2)當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到90％融合密度后，用PBS溶液清洗，加入0.2～0.25％胰蛋白酶溶液室溫消化1～2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，清洗細(xì)胞，加入混合培養(yǎng)液，輕輕吹打使之形成細(xì)胞懸浮液，按1∶2接種于新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，3～5天至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲取傳代培養(yǎng)的大鼠腔靜脈平滑肌細(xì)胞。

其中，步驟1)中消化液是：5mlHBSS平衡鹽溶液中加入39.5-40.5mgI型膠原酶、9.5～10.5mg牛血清白蛋白和0.65～0.75mg二硫蘇糖醇配制而成。按照此配方配制的消化液既能保證消化時(shí)間控制在一個(gè)較短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)不會(huì)傷害細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞的傷害最小。所述消化液也可以是：5mlHBSS平衡鹽溶液中加入31mg?I型膠原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫蘇糖醇配制而成，此配方的消化液能夠使消化時(shí)間控制在14-16min。

所述步驟1)獲取原代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的具體步驟為：

1)快速取出大鼠心肺組織放入含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液中洗除血污；將心肺組織置于體視顯微鏡下，沿氣管解剖結(jié)構(gòu)快速鈍性分離氣管周圍組織并反復(fù)用HBSS沖洗使視野清晰；將氣管剪下放入HBSS中反復(fù)漂洗至組織干凈光滑，剝離氣管外脂肪和纖維組織外膜，剪開氣管，刮除氣管內(nèi)外膜至其光滑為止，用HBSS反復(fù)沖洗去除內(nèi)皮細(xì)胞；

2)取出中膜平滑肌層組織，將其放入含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液中漂洗多次，至組織干凈透明，然后用消化液在37℃消化中膜組織25-30min，見組織塊松軟、邊緣發(fā)毛，呈一定程度的破碎狀；

3)加入混合培養(yǎng)液中和消化液，收集細(xì)胞懸浮液并離心，棄上清液后加入混合培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度以1～2×10⁵細(xì)胞/ml的密度種植于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，3-4天后換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期5-6天，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞。

所述步驟2)中每35mm單孔板需用胰蛋白酶溶液的用量為0.3～0.5ml，胰蛋白酶溶液中含0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)；所述的細(xì)胞接種密度為1～2×10⁵個(gè)/ml。

所述混合培養(yǎng)液為含95～105U/ml的青霉素、95～105U/ml的鏈霉素和10～20％胎牛血清的低糖DMEM(Dulbcco’s?Modifed?Eagle?Medium)培養(yǎng)液。

所述HBSS平衡鹽溶液為：1000ml三蒸水中加入7.6g氯化鈉、0.38g氯化鉀、0.25g氯化鎂、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。

所述含氯化鈣的HBSS平衡鹽溶液為上述HBSS平衡鹽溶液中每100ml加入150μl?1M氯化鈣溶液。

本發(fā)明具有以下有益效果：