[發明專利]利用噴墨打印技術制備梯度蛋白模版的方法

無效

• 申請號: 200910191951.0
• 申請日: 2009-12-16
• 公開（公告）號: CN101735946A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 蔡開勇;董海德
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 謝殿武

技術領域

本發明涉及血液感染病原菌的檢測方法，特別涉及一種利用噴墨打印技術制備梯度蛋白模版的方法。

背景技術

在過去的幾十年中，盡管組織工程已經取得了很大發展，但許多挑戰仍然存在。植入體在植入宿主后的微循環血管新生便是其中之一(Science，2002，295：1009-1014)。血管新生對于生物材料的成功植入和組織工程化構建非常必要，因為新生血管能夠為它們持久發揮功能提供所需的養分和氧氣。而內皮細胞的遷移和取向排列在血管生成的脈管重塑過程中發揮著非常必要且重要的作用。其原理是，內皮細胞自身的特異蛋白酶降解細胞外基質后，遷移進入血管周邊區域進行增殖、排列形成新血管。

內皮細胞的遷移和取向排列可以通過不同機制進行調控，比如，力學趨化性，和化學趨化性。趨化性指的是細胞沿一個具有化學濃度梯度的表面特定的運動或取向。血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)等可溶性生長因子的濃度梯度都能很好地介導內皮細胞取向排列。但在組織工程應用方面，材料表面偶聯梯度蛋白或多肽的材料在模擬生物微環境研究中尤其重要，它有利于開發具有生物傳導性的支架材料。

表面梯度是指在特定距離上，物體表面化學或物理屬性逐漸變化的一種狀態。體外研究內皮細胞遷移和取向性方面，梯度構建技術起著至關重要的作用。Genzer等利用擴散原理(Advanced?Material，2005，17：2802-2807)，首先在硅片上形成聚合引發劑梯度，進而引發聚合反應，構建聚羥乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)梯度模版，然后通過化學反應偶聯纖粘蛋白(FN)，最終得到纖粘蛋白濃度梯度模版，用于研究了成骨細胞的粘附、伸展及趨向性行為。在另一研究中，Heiko等(Langmuir，2005，21：7796-7804)報道了利用液體在固體中擴散來形成梯度的方法。所用固體介質為二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)，首先構造一特定模具，當硫醇溶液在重力作用下透過PDMS向下擴散時，由于PDMS的厚度不同，沿PDMS基材徑向吸附不同量的硫醇溶液，在將該PDMS模版壓印在金膜表面，進而形成了硫醇梯度，利用硫醇官能化基團固定蛋白質，形成了梯度蛋白模版。

但是，這些方法都有明顯缺陷，比如成本高、難于操作、易于污染和定量化。本發明旨在引入噴墨打印技術制備梯度蛋白模版，進而應用于細胞運動性研究。噴墨打印技術具有高度自動化、成本低及高重復性等優點，同時，噴墨打印技術是一種非接觸方法，操作中，打印機噴嘴和基材并不直接接觸，大大降低了交叉污染的風險。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種利用噴墨打印技術制備梯度蛋白模版的方法，利用噴墨打印技術設計具有高度重復性及可靠性的梯度蛋白模版以便用于細胞運動性研究，本發明的方法操作簡單、成本低廉、實施容易，可應用于不同蛋白的梯度模版構建。

本發明所述的利用噴墨打印技術制備梯度蛋白模版的方法，包括如下步驟：

a.對噴墨打印機進行改裝，步驟為：將噴射液裝入帶有芯片的空墨盒后再將墨盒裝于打印機上，以至少兩個由虹吸管連接起來的容器作為連續供墨系統，所述連續供墨系統一端與墨盒連通，另一端與噴射液貯池連通，所述噴射液為0.25-2mM端-COOH基硫醇的有機溶液；

b.依據灰度值與標準圖案的靜態接觸角的關系優化設計打印模版的灰度梯度，得線性優化灰度區間；

c.以噴金硅片作為初始基材、以線性優化灰度區間的灰度梯度為基準將端-COOH基的硫醇分子打印到初始基材上；

d.將打印所得的基材于反浸液中反浸5-30min后再于EDC/NHS體系中活化處理5-30min，所述反浸液為濃度不低于0.2mM的端-OH基硫醇的有機溶液；

e.將活化所得的基材與目標蛋白進行偶聯，得梯度蛋白模版。

進一步，所述線性優化灰度區間的具體設計方法如下：

(1)設計0-255區間的灰度值；

(2)以飽和端-COOH基硫醇的有機溶液為噴射液、從0-255灰度值中篩選不同灰度值并以所篩選的灰度值為基準打印圖案，以所得圖案作為標準圖案分別測量相應灰度圖案的靜態接觸角，依據灰度值與靜態接觸角的關系作曲線，得線性優化灰度區間；

進一步，所述噴射液為0.25-2mM的1-巰基十一烷酸的有機溶液；

進一步，所述噴金硅片的硅片表面由內向外依次為厚度不低于1nm的鉻層和50-200nm厚的金層，金層純度不小于99.99％；